ГОСТ Р 51440-99 Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Метод определения содержания патулина с помощью тонкослойной хроматографии. стр. 2

6 Проведение испытаний

6.1 Приготовление испытуемого раствора

При испытании концентрированных яблочных соков их разводят водой 1:5 по объему. Дальнейшую процедуру проводят для всех продуктов одинаково, как описано ниже.

Пробу объемом 50 см экстрагируют порцией смеси этилацетата с хлороформом (3:2 по объему) объемом 50 см³ в течение не менее 1 мин. Экстракцию повторяют еще два раза той же смесью новыми порциями объемом по 50 см³. Экстракты объединяют и фильтруют на воронке с пористым стеклянным фильтром через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см³, фильтрат собирают в отгонную колбу вместимостью 250 см³.

Экстракт упаривают на ротационном испарителе под вакуумом досуха, остаток количественно переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 см³, ополаскивая колбу четырьмя порциями этилацетата объемом по 5 см³. Объем содержимого в цилиндре доводят сначала до 25 см³ этилацетатом, затем до 100 см³ толуоло

6.2 Колоночная хроматография

В основание колонки (4.1) помещают ватный тампон. В колонку вносят 25 см³ толуола и суспензию 15 г силикагеля (3.3) в 40 см³ толуола. После оседания силикагеля в колонку вносят 15 г безводного сульфата натрия и дают растворителю стечь до верхней кромки насыпного слоя. В колонку вносят экстракт из исследуемой пробы, после чего растворителю дают стечь до верхней кромки насыпного слоя, элюат отбрасывают. В колонку вносят 200 см³ элюирующего раствора (3.4) и проводят элюирование при скорости потока около 5 см³/мин, элюат собирают в градуированный цилиндр. Собранный элюат упаривают приблизительно до объема 2 см³.

Сконцентрированный элюат количественно переносят в пробирку вместимостью 20 см³ с помощью четырех порций этилацетата объемом около 4 см³ каждая и упаривают досуха в токе азота. Остаток немедленно растворяют в 0,5 см³ этилацетата, так как патулин не стабиле

6.3 Тонкослойная хроматография

Пластинки для ТСХ, предварительно покрытые силикагелем (4.4), активируют при температуре 110 °С в течение 2 ч. С помощью капиллярной пипетки или микрошприца на пластинку в точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края и 2 см от нижнего края, наносят аликвотную часть очищенного экстракта из пробы (6.2) объемом 0,020 см³. В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от правого края и 2 см от нижнего края пластинки, наносят 0,005 см³ стандартного раствора патулина (3.5). В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края и 2 см от верхнего края пластинки, наносят также 0,005 см³ стандартного раствора патулина. В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края пластинки и 4 см от верхнего края пластинки, наносят 0,010 см³ стандартного раствора патулина (см. рисунок 1).

Рисунок 1 - Двумерная тонкослойная хроматография

390 × 342 пикс.     Открыть в новом окне

Хроматограмму развивают в направлении (рисунок 1), используя подвижную фазу бензол/метанол/уксусная кислота (3.2), до прохождения фронтом растворителя расстояния 14 см. Пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе, после чего развивают хроматограмму в направлении (рисунок 1), используя подвижную фазу толуол/этилацетат/муравьиная кислота (3.2), до прохождения фронтом растворителя расстояния 14 см. Пластинку вынимают из камеры и высушивают при комнатной температуре. Пластинку опрыскивают раствором гидрохлорида МБТГ (3.6), после чего высушивают в течение 15 мин в сушильном шкафу (4.5) при температуре 130 °С.

6.4 Определение количества патулина в экстракте

Количество патулина в экстракте определяют сравнением интенсивности флюоресценции пятна патулина из экстракта с пятнами патулина из стандартного раствора при облучении пластинки длинноволновым ультрафиолетовым светом. Пятно патулина из экстракта ищут на пересечении перпендикулярных линий, соединяющих пятна патулина из стандартного раствора. Если интенсивность флюоресценции пятна патулина из 0,020 см³ экстракта выше интенсивности флюоресценции пятен патулина из стандартного раствора, экстракт разводят этилацетатом и повторяют процедуру ТСХ-анализа по 6.3. Если интенсивность флюоресценции пятна патулина из экстракта сравнима с интенсивностью флюоресценции одного из пятен патулина из стандартного раствора, то концентрация патулина в анализируемой пробе составляет 25 мкг/дм³ либо 50 мкг/дм³ соответственно.

При проведении анализа описанным методом достигается полное отделение патулина от оксиметилфурфурола (ОМФ), поэтому последний не влияет на результаты анализа.

7 Обработка результатов

Содержание патулина в продукте , мкг/дм³, вычисляют по формуле

, (2)

где - конечный объем, до которого доведен очищенный экстракт, см³;

- объем экстракта из пробы, нанесенный на пластинку, см³;

- объем стандартного раствора патулина (3.5), соответствующий пятну той же интенсивности флюоресценции, что и пятно патулина из экстракта, см³;

- концентрация патулина в стандартном растворе, мкг/ см³;

50 - объем пробы, взятый для экстракции, см³.

8 Точность метода

8.1 Сходимость результатов

• =33,4 мкг/дм³; =29,4 мкг/дм³,

где - предел сходимости;

- среднеквадратическое отклонение сходимости.

8.2 Воспроизводимость результатов

=41,0 мкг/дм³; =35,8 мкг/дм³.

где - предел воспроизводимости;

- среднеквадратическое отклонение воспроизводимости.

9 Протокол испытаний

В протоколе испытаний указывают:

- метод испытаний;

- результат испытаний;

- окончательный результат с оценкой сходимости, если была проверена сходимость результатов.

Также следует отметить особенности проведения испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные, с побочными обстоятельствами, способными повлиять на результат испытаний.

Протокол испытаний должен содержать информацию, необходимую для полной идентификации образца.