5.5.2 Приготовление
Основные компоненты или полную обезвоженную среду растворяют в воде, в случае необходимости проводя нагрев. При необходимости корректируют рН так, чтобы после стерилизации он был равен (7,0±0,2) при температуре 25 °С. Среду разливают порциями по 10 см3 в пробирки. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °С в течение 15 мин.
Основные компоненты или полную обезвоженную среду растворяют в воде, в случае необходимости проводя нагрев. При необходимости корректируют рН так, чтобы после стерилизации он был равен (7,0±0,2) при температуре 25 °С. Среду разливают порциями по 10 см3 в пробирки. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121 °С в течение 15 мин.
5.5.3 Проверка эффективности
Определение селективности и производительности сред - по ИСО/ТУ 11133-1. Информация о критериях эффективности - в ИСО/ТУ 11133-2, таблица В.4.
Определение селективности и производительности сред - по ИСО/ТУ 11133-1. Информация о критериях эффективности - в ИСО/ТУ 11133-2, таблица В.4.
5.6 Реактив для обнаружения оксидазы
5.6.1 Состав:
N,N,N',N'-тетраметил-1,4-фенилендиамина, дигидрохлорид - 1,0 г;
вода - 100 см3.
N,N,N',N'-тетраметил-1,4-фенилендиамина, дигидрохлорид - 1,0 г;
вода - 100 см3.
5.6.2 Приготовление
Растворяют данный компонент в воде непосредственно перед использованием.
Растворяют данный компонент в воде непосредственно перед использованием.
6 Оборудование и химическая стеклянная посуда
Используют микробиологическое лабораторное оборудование по ИСО 7218 и, в частности, нижеприведенное.
6.1 Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ИСО 7218.
6.2 Сушильный шкаф, ламинарный бокс или термостат, способные функционировать в диапазоне температур от 37 °С до 55 °С.
6.3 Термостат, работающий при (41,5±1) °С.
6.4 Термостат, работающий при (25±1) °С.
6.5 Водяная баня, работающая в диапазоне 44 °С - 47 °С.
6.6 рН-метр с точностью 0,1 при 25 °С.
6.7 Сосуды, пробирки, колбы, пригодные для стерилизации и хранения разбавителя и питательных сред.
6.8 Чашки Петри, предпочтительно с выемками, стеклянные или пластиковые, диаметром 90-100 мм.
6.9 Градуированные пипетки с полным сливом, с широким отверстием, номинальной вместимостью 1 см3 и 10 см3, градуированные с делениями 0,1 см3.
6.10 Резиновые соски или любая другая система безопасности, которую можно адаптировать к градуированным пипеткам.
6.11 Стерильные петли платино-иридиевые, никелево-хромовые или пластиковые, диаметром приблизительно 3 мм, и проволоки из того же материала или стеклянная или пластиковая палочка.
Примечание - Никелево-хромовая петля не пригодна для использования в испытании с оксидазой (см. 9.4.3).
Примечание - Никелево-хромовая петля не пригодна для использования в испытании с оксидазой (см. 9.4.3).
6.12 Шпатель стеклянный или пластиковый.
6.13 Микроскоп, предпочтительно с фазовым контрастом (для наблюдения характерной подвижности Campylobacter).
6.14 Надлежащее оборудование для достижения микроаэробной атмосферы с содержанием кислорода (5±2)%, диоксида углерода (10±3)%, альтернативного водорода 10 %, с соблюдением баланса азота. Используют подходящие герметичные контейнеры, способные удерживать чашки Петри, например, бактериологические анаэробные сосуды. Необходимая микроаэробная атмосфера достигается при использовании имеющихся в продаже газогенераторных комплектов (следует в точности соблюдать производственные инструкции, в частности те из них, которые относятся к объему сосуда и вместимости газогенераторного комплекта). В качестве альтернативы используют промывание сосуда надлежащей газовой смесью перед инкубацией.
7 Отбор проб
В лабораторию направляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.
Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Отбор проб проводят в соответствии с конкретным стандартом на данную продукцию. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по отбору проб конкретного продукта при отсутствии соответствующего стандарта.
Принимая во внимание, что Campylobacter spp. весьма чувствительны к замораживанию, испытуемые пробы следует хранить при температуре (3±2) °С и анализировать в кратчайшие сроки. Принимают меры по предотвращению высыхания проб.
8 Приготовление испытуемой пробы
Испытуемую пробу приготовляют в соответствии с конкретным стандартом на определенного вида продукцию. Если не существует конкретного стандарта, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли соглашения по данному вопросу.
9 Методика проведения испытания
9.1 Подготовка пробы, исходной суспензии и разбавление - по ИСО 6887 и конкретному стандарту на продукцию определенного вида.
Приготовляют единичную серию десятичных разбавлений на основе испытуемой пробы, если продукция жидкая, или на основе исходной суспензии в случае продукции других видов.
Приготовляют единичную серию десятичных разбавлений на основе испытуемой пробы, если продукция жидкая, или на основе исходной суспензии в случае продукции других видов.
9.2 Инокуляция и инкубация
9.2.1 Используя стерильную пипетку (6.9), переносят 0,1 см3 исходных суспензий (9.1) в обе чашки с агаровой средой mCCD (5.3). Тщательно и равномерно размазывают инокулят как можно быстрее по поверхности слоя, при этом не касаясь сторон чашки, используя стерильный шпатель (6.12), до тех пор, пока на поверхности агара не исчезнет вся видимая жидкость.
При необходимости данную процедуру повторяют с последующими десятичными разбавлениями.
Если для некоторых видов продукции необходимо оценить малое количество Campylobacter, предел подсчета может быть снижен на коэффициент 10 путем исследования 1,0 см3 исходной суспензии.
1,0 см3 инокулята распределяют на поверхности агаровой среды в широкой чашке Петри (140 мм) или на поверхности агаровой среды в трех небольших чашках (90 мм), используя стерильный шпатель (6.12). В обоих случаях приготовляют дублирующие пробы, используя две большие чашки или шесть маленьких чашек.
При необходимости данную процедуру повторяют с последующими десятичными разбавлениями.
Если для некоторых видов продукции необходимо оценить малое количество Campylobacter, предел подсчета может быть снижен на коэффициент 10 путем исследования 1,0 см3 исходной суспензии.
1,0 см3 инокулята распределяют на поверхности агаровой среды в широкой чашке Петри (140 мм) или на поверхности агаровой среды в трех небольших чашках (90 мм), используя стерильный шпатель (6.12). В обоих случаях приготовляют дублирующие пробы, используя две большие чашки или шесть маленьких чашек.
9.2.2 Чашки (9.2.1) инкубируют при температуре 41,5 °С в течение 40-48 ч в микроаэробной атмосфере (6.14).
9.3 Подсчет и отбор колоний для подтверждения
9.3.1 На агаре mCCD типичные колонии имеют сероватый цвет, нередко с металлическим отблеском, они плоские и влажные, с тенденцией к распространению. Размеры колоний уменьшаются на более сухой агаровой поверхности. Могут появиться другие формы колоний.
Отбирают чашки (9.2.2), содержащие менее 150 типичных или подозрительных колоний; эти колонии подсчитывают. Затем отбирают случайным образом пять таких колоний для субкультивирования для проведения подтверждающих испытаний (9.4).
Отбирают чашки (9.2.2), содержащие менее 150 типичных или подозрительных колоний; эти колонии подсчитывают. Затем отбирают случайным образом пять таких колоний для субкультивирования для проведения подтверждающих испытаний (9.4).
9.3.2 Проводят штриховой посев каждой из отобранных колоний (9.3.1) на чашки с колумбийским кровяным агаром (5.4) с целью содействия развитию четко изолированных колоний. Чашки инкубируют в микроаэробной атмосфере при температуре 41,5 °С в течение 24-48 ч. Для исследования морфологии, подвижности, микроаэробного роста при температуре 25 °С, аэробного роста при температуре 41,5 °С и наличия оксидазы используют чистые культуры.
9.4 Подтверждение вида Campylobacter
9.4.1 Исследование морфологии и подвижности
9.4.1.1 Суспендируют одну колонию из чашки с колумбийским кровяным агаром (9.3.2) в 1 см3 жидкой среды для бруцелл (5.5) и анализируют морфологию и подвижность с использованием микроскопа (6.13).
9.4.1.2 Для последующих исследований сохраняют все культуры (9.3.2), в которых обнаружены изогнутые бациллы с подвижностью спирального штопора (9.4.1.1).
9.4.2 Исследование аэробного роста при температурах 25 °С и 41,5 °С
Используя изолированные колонии, указанные в 9.4.1.2, при помощи петли (6.11) инокулируют поверхность обеих чашек с колумбийским кровяным агаром (5.4).
Инкубируют одну чашку при температуре 25 °С в аэробной атмосфере (6.14) в течение 40-48 ч. Инкубируют вторую чашку при температуре 41,5 °С в аэробной атмосфере в течение 40-48 ч.
Исследуют чашки на предмет видимого роста колоний Campylobacter.
Используя изолированные колонии, указанные в 9.4.1.2, при помощи петли (6.11) инокулируют поверхность обеих чашек с колумбийским кровяным агаром (5.4).
Инкубируют одну чашку при температуре 25 °С в аэробной атмосфере (6.14) в течение 40-48 ч. Инкубируют вторую чашку при температуре 41,5 °С в аэробной атмосфере в течение 40-48 ч.
Исследуют чашки на предмет видимого роста колоний Campylobacter.
9.4.3 Обнаружение оксидазы
Используя платиново-иридиевую петлю или стеклянную палочку (6.11), отбирают порцию четко изолированной колонии из каждой отдельной чашки (9.4.1.2) и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для обнаружения оксидазы (5.6). Появление лилового, сиреневого или темно-синего цвета в течение 10 с свидетельствует о положительной реакции. Если используется имеющийся в продаже набор для анализа оксидазы, необходимо следовать инструкциям изготовителя.
Результаты подтверждают, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (положительный контроль) и Escherichia coli NCTC 9001 (отрицательный контроль).
Используя платиново-иридиевую петлю или стеклянную палочку (6.11), отбирают порцию четко изолированной колонии из каждой отдельной чашки (9.4.1.2) и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом для обнаружения оксидазы (5.6). Появление лилового, сиреневого или темно-синего цвета в течение 10 с свидетельствует о положительной реакции. Если используется имеющийся в продаже набор для анализа оксидазы, необходимо следовать инструкциям изготовителя.
Результаты подтверждают, используя положительный и отрицательный контроль. Примерами подходящих контрольных штаммов являются Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662 (положительный контроль) и Escherichia coli NCTC 9001 (отрицательный контроль).
9.4.4 Интерпретация
Campylobacter spp. дает результаты согласно таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики Campylobacter spp.
Campylobacter spp. дает результаты согласно таблице 1.
Таблица 1 - Характеристики Campylobacter spp.
Наименование показателя | Характеристика |
Морфология (9.4.1) | Малые искривленные бациллы |
Подвижность (9.4.1) | Характерная |
Микроаэробный рост при 25 °С (9.4.2) | - |
Аэробный рост при 41,5 °С (9.4.2) | - |
Оксидаза (9.4.3) | + |
10 Обработка результатов
10.1 Подсчет колоний Campylobacter
10.1.1 Если подтверждается по крайней мере 80% отобранных колоний (9.4.4), в качестве числа Campylobacter берут число, приведенное в подсчете в соответствии с 9.3.
10.1.2 Во всех остальных случаях рассчитывают число Campylobacter, которое было получено в соответствии с 9.3 и подтверждено (9.4.4). Результат округляют до целого числа колоний.
10.2 Метод расчета
10.2.1 Общий случай - чашки, содержащие от 15 до 150 колоний презумптивных Campylobacter
Рассчитывают число N Campylobacter, присутствующих в испытуемой пробе как средневзвешенное значение на основе двух последовательных разбавлений, используя уравнение:
Рассчитывают число N Campylobacter, присутствующих в испытуемой пробе как средневзвешенное значение на основе двух последовательных разбавлений, используя уравнение:
 | |
| 683 × 359 пикс. Открыть в новом окне | |
В качестве результата принимают число предпочтительно между 1,0 и 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени или целое число с двумя значащими цифрами.
Результат выражают следующим образом:
число N Campylobacter на см3 (жидкого продукта) или на грамм (другие виды продукции).
ПРИМЕР - Подсчет дал следующие результаты:
- при оставшемся первом разбавлении (10-2): 66 или 80 колоний;
- при оставшемся втором разбавлении (10-3): четыре или семь колоний.
Было проведено испытание отобранных колоний:
- для 66 колоний: пять колоний, четыре из которых согласуются с приведенным критерием a=66 (см. 10.1.1);
- для 80 колоний: пять колоний, три из которых согласуются с приведенным критерием a=48;
- для семи колоний: пять колоний, четыре из которых согласуются с приведенным критерием a=7;
- для четырех колоний: все четыре колонии подтверждены.
 | |
| 674 × 137 пикс. Открыть в новом окне | |
10.2.2 Случай двух чашек, содержащих менее 15 колоний
Если обе чашки при инокуляции и выдержке в случае испытуемой пробы (жидкий продукт), исходной суспензии (другие виды продуктов) или первого разбавления содержат менее 15 типичных колоний, рассчитывают предполагаемое число N Campylobacter, присутствующих в испытуемой пробе как среднеарифметическое значение колоний, подсчитанных на обеих чашках, по уравнению:
Если обе чашки при инокуляции и выдержке в случае испытуемой пробы (жидкий продукт), исходной суспензии (другие виды продуктов) или первого разбавления содержат менее 15 типичных колоний, рассчитывают предполагаемое число N Campylobacter, присутствующих в испытуемой пробе как среднеарифметическое значение колоний, подсчитанных на обеих чашках, по уравнению: