Метод определения биохимического потребления кислорода
Е.1 Определение биохимического потребления кислорода (БПК) проводят в первоначальной или в соответственно разбавленной пробе по разности между содержанием кислорода до и после инкубации при стандартных условиях. Стандартной была признана продолжительность инкубации, равная пяти суткам при 20 °С, без доступа воздуха и света. Потребление кислорода, определяемое при этих условиях, называется пятисуточным биохимическим потреблением кислорода - БПК
.
. Кроме этих главных условий основного характера БПК, ход определения ограничен рядом правил, соблюдение которых необходимо для получения сопоставимых результатов. В первую очередь следует строго соблюдать условия, при которых во время определения количество присутствующего кислорода соответствовало бы его потреблению. Это соответствие зависит от степени разбавления проб с большим БПК, применения одной и той же разбавляющей воды и одного и того же способа обработки воды перед анализом.
Содержание кислорода в первоначальной или разбавленной пробе должно оставаться в течение всего времени инкубации таким, чтобы были обеспечены нормальные условия протекания аэробных биохимических процессов. Эти условия будут соблюдены, если анализируемая проба или смесь пробы с разбавляющей водой перед началом определения будет насыщена кислородом воздуха приблизительно до 8,8 мг/дм
при 20 °С и если во время инкубационного периода произойдет снижение концентрации кислорода на 50%, но так, чтобы остающаяся концентрация кислорода спустя пять дней составила не менее 3 мг/дм .
при 20 °С и если во время инкубационного периода произойдет снижение концентрации кислорода на 50%, но так, чтобы остающаяся концентрация кислорода спустя пять дней составила не менее 3 мг/дм . Пробы с высоким БПК анализируют при разведении их разбавляющей водой в таком отношении, чтобы были соблюдены вышеуказанные оптимальные условия. Разбавление пробы проводят на основании предполагаемого БПК.
Для приблизительного расчета требуемого разбавления используют бихроматную окисляемость пробы.
Условно принимают, что биохимическое потребление кислорода составляет 40%-60% ХПК, но так как в воде после инкубации при правильно взятом разбавлении должно остаться примерно 3-5 мг кислорода на 1 дм , то вычисляемое значение БПК делят на четыре или пять. Полученный результат показывает, во сколько раз надо разбавлять анализируемую воду.
, то вычисляемое значение БПК делят на четыре или пять. Полученный результат показывает, во сколько раз надо разбавлять анализируемую воду. Пример - Химическое потребление кислорода воды равно 5000 мг кислорода на 1 дм . Принимаем БПК, равным 60% ХПК, это составляет 3000 мг кислорода на 1 дм . Делим это значение на 5, получаем, что пробу надо разбавить в 600 раз.
. Принимаем БПК, равным 60% ХПК, это составляет 3000 мг кислорода на 1 дм . Делим это значение на 5, получаем, что пробу надо разбавить в 600 раз. Е.2 Аппаратура и реактивы
Термостат, установленный на 20 °С, с допустимым отклонением ±1 °С. Целесообразно применять термостат с водяным охлаждением, который обеспечивает указанную температуру и в летнее время.
Устройство для аэрации с распределением воздуха через несколько трубок. Воздух пропускают через ватный фильтр и стеклянную фильтрующую пластинку.
Разбавляющая вода.
Для приготовления ее берут 1 дм дистиллированной воды, насыщенной при 20 °С кислородом воздуха, прибавляют 0,3 г натрия углекислого, кислого (NaHCI
) для доведения рН до 7,0-8,0. Чистоту разбавляющей воды проверяют следующим образом. Четыре кислородные склянки заполняют разбавляющей водой; в двух из них определяют кислород в день исследования пробы ("нулевой день"), а в двух других, которые помещают в термостат с анализирующими пробами, определяют содержание кислорода на пятый день. Разность между средней концентрацией кислорода в "нулевой" пробе и в пробе, взятой на пятый день, не должна превышать 0,5 мг/дм .
дистиллированной воды, насыщенной при 20 °С кислородом воздуха, прибавляют 0,3 г натрия углекислого, кислого (NaHCI ) для доведения рН до 7,0-8,0. Чистоту разбавляющей воды проверяют следующим образом. Четыре кислородные склянки заполняют разбавляющей водой; в двух из них определяют кислород в день исследования пробы ("нулевой день"), а в двух других, которые помещают в термостат с анализирующими пробами, определяют содержание кислорода на пятый день. Разность между средней концентрацией кислорода в "нулевой" пробе и в пробе, взятой на пятый день, не должна превышать 0,5 мг/дм . Сульфат марганца (II), раствор.
Растворяют 400 г сульфата марганца MnSO
·2H
O (или 480 г MnSO ·4Н О или 364 г MnSO ·H O) в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм , фильтруют через бумажный фильтр.
·2H O (или 480 г MnSO ·4Н О или 364 г MnSO ·H O) в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм , фильтруют через бумажный фильтр. Едкий калий с йодидом натрия, раствор (реактив Винклера).
Растворяют 700 г едкого калия (KОН) и 150 г йодида натрия (NaJ) в 700 см дистиллированной воды и доводят до 1 дм . Проверку качества реактива проводят следующим образом. В колбу добавляют 100 см дистиллированной воды и 10 см разбавленной (1:4) серной кислоты, 2 см раствора реактива, после прибавления 5 см раствора крахмала не должна появиться окраска.
дистиллированной воды и доводят до 1 дм . Проверку качества реактива проводят следующим образом. В колбу добавляют 100 см дистиллированной воды и 10 см разбавленной (1:4) серной кислоты, 2 см раствора реактива, после прибавления 5 см раствора крахмала не должна появиться окраска. Серная кислота, ч.д.а. (1:4; 2:3).
Тиосульфат натрия 0,1 н; 0,01 нормальные растворы.
Бихромат калия 0,1 и 0,01 нормальные растворы.
Сульфиниловая кислота или мочевина, 40%-ный раствор.
Крахмал, 0,5%-ный раствор.
Смешивают 5 г растворимого крахмала чистого для анализа (ч.д.а.) с 50 см дистиллированной воды и приливают к 950 см кипящей дистиллированной воды. Раствор консервируют прибавлением небольшого количества йодида ртути или хлороформа.
дистиллированной воды и приливают к 950 см кипящей дистиллированной воды. Раствор консервируют прибавлением небольшого количества йодида ртути или хлороформа. Е.3 Проведение анализа
Отбирают пипеткой рассчитанное по ХПК количество жидкого навоза, помещают в мерную колбу на 1 дм , доводят разбавленной водой до метки.
, доводят разбавленной водой до метки. Подготовленную таким образом пробу перемешивают и наливают в четыре кислородные склянки. Каждую кислородную склянку ополаскивают приблизительно 30 см подготовленной пробы и наполняют сифоном до самого края. Если подготовленная проба содержит взвешенные вещества, содержимое колбы перемешивают перед каждым переливанием.
подготовленной пробы и наполняют сифоном до самого края. Если подготовленная проба содержит взвешенные вещества, содержимое колбы перемешивают перед каждым переливанием. Наполненную кислородную склянку закрывают так, чтобы внутри не осталось пузырьков воздуха.
В двух из четырех кислородных склянок тотчас же определяют кислород. Время между разбавлением пробы и фиксированием кислорода при определении концентрации его в день отбора пробы должно быть не более 15 мин.
Оставшиеся две кислородные склянки помещают в термостат в мелкие чашки или фарфоровые кюветы, наполненные дистиллированной водой. Кислородные склянки помещают пробками вниз, погружая горло в воду (водяной затвор). Дистиллированную воду обновляют в каждом определении. Кислородные склянки хранят при температуре 20 °С в течение 5 сут.
Затем в обеих кислородных склянках определяют концентрацию растворенного кислорода. Определение кислорода в "нулевой" и пятый дни проводят по методу Винклера.
В пробы добавляют 1 см сульфата марганца и 1 см реактива Винклера, погружая каждый раз кончик пипетки или бюретки в пробу, быстро закрывают пробкой без пузырьков воздуха и тщательно перемешивают, при добавлении реактивов выливаются 2 см жидкости испытуемой пробы, которые потом учитываются при расчете.
сульфата марганца и 1 см реактива Винклера, погружая каждый раз кончик пипетки или бюретки в пробу, быстро закрывают пробкой без пузырьков воздуха и тщательно перемешивают, при добавлении реактивов выливаются 2 см жидкости испытуемой пробы, которые потом учитываются при расчете. Образовавшемуся осадку гидроокиси марганца дают отстояться не менее 10 мин и растворяют в 2 см H SO (2:3), закрывают пробкой и тщательно перемешивают, вылитая жидкость не учитывается.
H SO (2:3), закрывают пробкой и тщательно перемешивают, вылитая жидкость не учитывается. В колбу для титрования переносят содержимое склянки или отбирают 100 см и титруют раствором 0,1 н. тиосульфата натрия до светло-желтой окраски, затем прибавляют крахмал и продолжают титровать до исчезновения синей окраски.
и титруют раствором 0,1 н. тиосульфата натрия до светло-желтой окраски, затем прибавляют крахмал и продолжают титровать до исчезновения синей окраски. Биохимическую потребность кислорода 
, мг/дм О , вычисляют по формуле
, мг/дм О , вычисляют по формуле  | |
| 205 × 47 пикс. Открыть в новом окне | |
где 
- объем тиосульфата натрия, пошедшего на титрование пробы в "нулевой день", см ;
- объем тиосульфата натрия, пошедшего на титрование пробы в "нулевой день", см ;
- объем тиосульфата натрия, пошедшего на титрование пробы в пятый день, см ;
- поправочный коэффициент тиосульфата натрия; 8000 - молярная масса 1/2 О , мг/дм ;
, мг/дм ;
- объем пробы, взятый для анализа с расчетом всех разбавлений, см .Приложение Ж
(рекомендуемое)
Метод бактериологического исследования навоза
Пробу объемом 50-100 см тщательно перемешивают, после чего стерильной пипеткой отбирают 1 см сточной жидкости и готовят необходимое для посева разведение: в пробирку с 9 см стерильной водопроводной воды вносят 1 см исследуемой сточной жидкости и после тщательного перемешивания переносят в последующие пробирки с 9 см стерильной воды по 1 см предыдущего разведения. Для определения общего числа бактерий рекомендуется делать посев из 10
, 10
, 10
разведения, 1 см жидкости выбранного разведения вносят в стерильную чашку Петри и заливают остуженным до 45 °С полуторапроцентным мясопептонным агаром. Осторожно покачивая чашки, перемешивают содержимое и после застывания агара перевернутые чашки помещают в термостат. На крышки чашек наносят надпись с указанием номера или названия пробы, разведения и даты посева. Посевы инкубируют 24 ч при температуре (37,0±0,5) °С. Учет выросших колоний проводят с помощью лупы 4-5-кратного увеличения. Подсчету подлежат все выросшие по чашкам колонии как в глубине, так и на поверхности среды. Путем последующего пересчета, учитывая разведения, определяют количество микроорганизмов в 1 см исследуемой пробы.
тщательно перемешивают, после чего стерильной пипеткой отбирают 1 см сточной жидкости и готовят необходимое для посева разведение: в пробирку с 9 см стерильной водопроводной воды вносят 1 см исследуемой сточной жидкости и после тщательного перемешивания переносят в последующие пробирки с 9 см стерильной воды по 1 см предыдущего разведения. Для определения общего числа бактерий рекомендуется делать посев из 10 , 10 , 10 разведения, 1 см жидкости выбранного разведения вносят в стерильную чашку Петри и заливают остуженным до 45 °С полуторапроцентным мясопептонным агаром. Осторожно покачивая чашки, перемешивают содержимое и после застывания агара перевернутые чашки помещают в термостат. На крышки чашек наносят надпись с указанием номера или названия пробы, разведения и даты посева. Посевы инкубируют 24 ч при температуре (37,0±0,5) °С. Учет выросших колоний проводят с помощью лупы 4-5-кратного увеличения. Подсчету подлежат все выросшие по чашкам колонии как в глубине, так и на поверхности среды. Путем последующего пересчета, учитывая разведения, определяют количество микроорганизмов в 1 см исследуемой пробы. Определение коли-титра проводят следующим образом:
Метод основан на способности бактерий кишечной палочки восстановить бесцветный раствор трифенилтетразолхлорида (ТТХ) в устойчивое соединение трифенилформазана, который плохо растворим в воде, выпадает в виде осадка и придает питательной среде интенсивный красный цвет. Эффективность указанной среды заключается в том, что кишечная палочка довольно устойчива к влиянию формазана, в то время как развитие сопутствующей микрофлоры не тормозится.
Приготовление индикатора.
К 100 см стерильной дистиллированной воды добавляют 2 г трифенилтетразолхлорида. Раствор чувствителен к свету и должен храниться в темноте или в темной таре.
стерильной дистиллированной воды добавляют 2 г трифенилтетразолхлорида. Раствор чувствителен к свету и должен храниться в темноте или в темной таре. Приготовление питательной среды.
К 100 см мясопептонного бульона добавляют 0,5 дм лактозы и после тщательного перемешивания устанавливают рН 6,2-6,4. Питательную среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. Перед посевом в каждую пробирку добавляют 2%-ный раствор трифенилтетразолхлорида из расчета 0,3 см на 9 см среды.
мясопептонного бульона добавляют 0,5 дм лактозы и после тщательного перемешивания устанавливают рН 6,2-6,4. Питательную среду разливают в пробирки и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. Перед посевом в каждую пробирку добавляют 2%-ный раствор трифенилтетразолхлорида из расчета 0,3 см на 9 см среды.