ГОСТ Р 52173-2003 Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения стр. 4

  1. Документы
  2. Госты РФ
6.2.7 Осадки, приготовленные по 6.2.6, растворяют в 50-100 мм деионизированной воды и получают раствор ДНК.
Растворы ДНК, приготовленные по 6.2.7, непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20 °С сроком до одного года в морозильной камере.
6.3 Приготовление реакционных смесей N 1 и N 2
6.3.1 Приготовление реакционной смеси N 1 на пять проб
В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см , помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм деионизированной воды, 52,5 мм 10х буфера для ПЦР с хлоридом магния по 4.38, [17], 26 мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм праймера на промотор 35S-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм ) по 4.44, [26], 13 мм праймера на промотор 35S-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм ) по 4.44, [26], 2,5 мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм ) по 4.37, [16], 52,5 мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузыр
ьков.
6.3.2 Приготовление реакционной смеси N 2 на пять проб
В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см , помещенную в кювету со льдом, вносят 312,5 мм деионизированной воды, 52,5 мм 10х буфера для ПЦР с хлоридом магния, 26 мм смеси нуклеотидов, приготовленной по 6.1.9, 13 мм праймера на терминатор nos-1 (концентрацией 20 мкмоль/дм ) по 4.45, [27], 13 мм праймера на терминатор nos-2 (концентрацией 20 мкмоль/дм ) по 4.45, [27], 2,5 мм фермента Taq-полимеразы (концентрацией 5 ед/мм ), 52,5 мм раствора БСА, приготовленного по 6.1.8. Смесь перемешивают 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены или пузырьков.
6.3.3 Реакционные смеси N 1 и N 2, приготовленные по 6.3.1 и 6.3.2, центрифугируют на настольной микроцентрифуге 30 с при частоте вращения 3000 мин . Реакционную смесь N 1 разливают по 90 мм в пять микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см (или 0,5 см в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционную смесь N 2 разливают по 90 мм в пять других микроцентрифужных пробирок вместимостью 0,2 см (или 0,5 см в зависимости от типа используемого амплификатора) для проведения ПЦР. Реакционные смеси N 1 и N 2 готовят непосредственно перед проведением ПЦР.

7 Проведение анализа

7.1 В первые две пробирки с реакционной смесью N 1 и в первые две пробирки с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из анализируемого продукта, приготовленный по 6.2.1.1-6.2.1.7, по 2 мм в каждую.
В третью пробирку с реакционной смесью N 1 и в третью пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0), no 2 мм в каждую.
В четвертую пробирку с реакционной смесью N 1 и в четвертую пробирку с реакционной смесью N 2 добавляют автоматическим микродозатором раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), пo 2 мм в каждую.
В пятую пробирку с реакционной смесью N 1 и в пятую пробирку с реакционной смесью N 2 автоматическим микродозатором добавляют деионизированную воду по 2 мм в каждую - холостой опыт.
7.2 В каждую пробирку со смесью по 7.1 добавляют, не перемешивая, по одной капле (20-40 мм ) вазелинового масла по ГОСТ 3164.
7.3 Пробирки со смесями, подготовленными по 7.2, помещают в амплификатор для проведения ПЦР. Программа амплификации для праймеров на промотор 35S приведена в таблице 1, на терминатор nos - в таблице 2.
Таблица 1 - Условия амплификации для 35S промотора
Стадия Тип амплификатора
Crocodile II Gene Amp 2400 Progene Trio Терцик МС-2
Денатурация 2 мин/98 °С 3 мин/94 °С 3 мин/95 °С 2 мин/96 °С 3 мин/94 °С
Амплификация 8 с/95 °С 20 с/94 °С 36 с/95 °С 30 с/95 °С 20 с/94 °С
30 с/54 °С 40 с/54 °С 72 с/54 °С 40 с/54 °С 40 с/54 °С
40 с/72 °С 60 с/72 °С 84 с/72 °С 40 с/72 °С 60 с/72 °С
Количество циклов 40 40 40 40 40
Конечное удлинение 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С
Фаза остывания 1 мин/30 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С
Скорость нагрева 1 °С/с 0,77 °С/с 1,5 °С/с 1 °С/с 0,77 °С/с
Скорость остывания 1 °С/с 3,15 °С/с 1,5 °С/с 1 °С/с 3,15 °С/с
Таблица 2 - Условия амплификации для терминатора nos
Стадия Тип амплификатора
Crocodile II Gene Amp 2400 Progene Trio Терцик МС-2
Денатурация 3 мин/95 °С 3 мин/94 °С 3 мин/95 °С 2 мин/98 °С 3 мин/94 °С
Амплификация 20 с/95 °С 20 с/94 °С 36 с/95 °С 30 с/95 °С 20 с/94 °С
40 с/54 °С 40 с/54 C 72 с/54 °С 40 с/54 °С 40 с/54 °С
40 с/72 °С 60 с/72 °С 84 с/72 °С 40 с/72 °С 60 с/72 °С
Количество циклов 40 40 40 40 40
Конечное удлинение 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С 3 мин/72 °С
Фаза остывания 1 мин/30 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С 1 мин/4 °С
Скорость нагрева 1 °С/с 0,77 °С/с 1,5 °С/с 1 °С /с 0,77 °С/с
Скорость остывания 1 °С/с 3,15 °С /с 1,5 °С/с 1 °С/с 3,15 °С/с
7.4 По окончании ПЦР из каждой микроцентрифужной пробирки осторожно из-под слоя вазелинового масла отбирают по 8 мм смеси и переносят в отдельный карман геля, приготовленного по 6.1.12.
7.5 В отдельный карман геля вносят 8 мм маркера молекулярной массы ДНК по 4.40, [19].
7.6 Гель помещают в камеру прибора по 4.2, [2] для проведения горизонтального электрофореза, заполненную буфером 1хТБЕ.
Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 6 В/см геля в условиях стабилизации напряжения в течение 65 мин.
7.7 Визуализацию продуктов ПЦР после электрофореза осуществляют с помощью видеосистемы по 4.4, [4].
7.8 Результат идентификации в виде файл-паспорта сохраняется на жестком магнитном носителе и может быть выведен на видеомонитор или принтер. Примеры изображений приведены в приложениях А и Б.

8 Обработка результатов анализа

8.1 В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего промотор 35S] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.). В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)] и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 195 пар нуклеотидов (п.н.).
8.2 В пробе со стандартом ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), содержащего терминатор nos] должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н. В пробе со стандартом без ГМИ [ДНК, выделенная из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения состава (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0)] и в холостом опыте не должна присутствовать окрашенная полоса, размер ПЦР-продукта, формирующего эту полосу на гель-электрофореграмме, составляет 180 п.н.
8.3 Интерпретация результатов
8.3.1 Отсутствие в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.
8.3.2 Обнаружение в анализируемой пробе ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н., или одного из них, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников в анализируемом продукте.
8.3.3 В случае обнаружения в одной из параллельно анализируемых проб и отсутствия в другой из параллельно анализируемых проб ПЦР-продуктов необходимо повторить весь анализ с еще одной навеской анализируемого продукта.
8.3.4 Обнаружение в отрицательных контролях ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноположительного результата. Это возможно при загрязнении ГМИ оборудования и/или реактивов. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и дозаторов раствором соляной кислоты (1 моль/дм ), заменить реактивы на свежеприготовленные, повторить амплификацию.
8.3.5 Отсутствие в положительном контроле ПЦР-продуктов размером 195 п.н. и 180 п.н. свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Это возможно в случае потери активности одного из компонентов реакционной смеси для ПЦР. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить амплификацию.

9 Контроль результатов идентификации

Для контроля результатов идентификации используют положительный контроль - раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5), и два отрицательных контроля - холостой опыт и раствор ДНК, выделенной из стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0).

10 Требования безопасности

10.1 При выполнении работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007. При работе с раствором бромистого этидия и окрашенным гелем необходимо работать в резиновых перчатках.
10.2 Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
10.3 При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. При работе с УФ-излучением необходимо пользоваться защитным экраном и защитными очками.

Приложение А

(обязательное)
Пример фотографии результата электрофореза для идентификации генетически модифицированных источников: рекомбинантная ДНК (промотор 35S)
350 × 283 пикс.     Открыть в новом окне
1, 2 - анализируемые пробы; 3 - маркер молекулярной массы 100 п.н.;
4 - стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи
растительного происхождения; 5 - стандартный образец состава генетически
не модифицированного источника пищи растительного происхождения; 6 - холостой опыт

Приложение Б

Содержание
Межгосударственный стандарт ГОСТ 26933-86"Сырье и продукты пищевые. Методы определения кадмия"(утв. постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25 июня 1986 г. N 1775)
Межгосударственный стандарт ГОСТ 26930-86 "Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка" (утв. постановлением Госстандарта CCCP от 25 июня 1986 г. N 1772)
Межгосударственный стандарт ГОСТ 26931-86"Сырье и продукты пищевые. Методы определения меди"(утв. и введен в действие постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25 июня 1986 г. N 1733)
Межгосударственный стандарт ГОСТ 26933-86 "Сырье и продукты пищевые. Методы определения кадмия" (утв. постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25 июня 1986 г. N 1775)
Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54085-2010 "Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Shigella" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. N 745-ст)