Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных выше.
5 Отбор проб
Отбор проб проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевого сырья и пищевых продуктов.
6 Подготовка к проведению анализа
6.1 Приготовление растворов
6.1.1 Приготовление раствора концентрацией 
(Трис-НСl)=1 моль/дм
(Трис-НСl)=1 моль/дм В мерную колбу по ГОСТ 12738 вместимостью 100 см помещают 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана по 4.33, [12] растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды по 4.32, [11]. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.
помещают 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана по 4.33, [12] растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды по 4.32, [11]. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5, затем доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. 6.1.2 Приготовление раствора концентрацией (NaCI)=5 моль/дм
(NaCI)=5 моль/дм В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.
помещают 29,22 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. 6.1.3 Приготовление раствора концентрацией (NaOH)=30%
(NaOH)=30% В колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 см деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.
помещают 3 г гидроокиси натрия по ГОСТ 4328, растворяют в 7 см деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. 6.1.4 Приготовление раствора концентрацией (ЭДТА)=0,5 моль/дм
(ЭДТА)=0,5 моль/дм В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23, [8], растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят рН раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают.
помещают 14,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты по 4.23, [8], растворяют в приблизительно 80 см деионизированной воды. Раствором гидроокиси натрия, приготовленным по 6.1.3, доводят рН раствора до 8,0, деионизированной водой доводят до метки и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.
6.1.5 Приготовление лизирующего буфера
В мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 25 см помещают 0,5 г бромида гексадецилтриметиламмония, растворяют в 10 см деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 см раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.1, 7 см раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают.
помещают 0,5 г бромида гексадецилтриметиламмония, растворяют в 10 см деионизированной воды, добавляют автоматическим микродозатором 2,5 см раствора Трис-HCl, приготовленного по 6.1.1, 7 см раствора хлористого натрия, приготовленного по 6.1.2, 1 см раствора ЭДТА, приготовленного по 6.1.4, доводят деионизированной водой до метки, перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес. В случае выпадения осадка при хранении раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате по 4.8, [6] при температуре 65 °С до полного растворения.
Непосредственно перед использованием в приготовленный раствор добавляют автоматическим микродозатором меркаптоэтанол по 4.34, [13] из расчета 4 мм на 1 см лизирующего буфера и перемешивают.
на 1 см лизирующего буфера и перемешивают. 6.1.6 Приготовление хлороформа, насыщенного водой
В колбу вместимостью 200 см вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 см хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 см деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения.
вносят цилиндром по ГОСТ 1770 100 см хлороформа по ГОСТ 20015, добавляют 20 см деионизированной воды по ГОСТ 6709, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.
6.1.7 Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта
В колбу вместимостью 200 см вносят цилиндром 70 см 96%-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 см деионизированной воды и перемешивают.
вносят цилиндром 70 см 96%-ного этилового ректификованного спирта по ГОСТ Р 51652, добавляют 26 см деионизированной воды и перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 6 мес.
6.1.8 Приготовление раствора концентрацией (БСА)=20 мкг/см
(БСА)=20 мкг/см В пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, [15], добавляют 1 см деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 мм приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см , добавляют 1 см деионизированной воды и перемешивают.
помещают 0,002 г сухого БСА по 4.36, [15], добавляют 1 см деионизированной воды, перемешивают до полного растворения. Отбирают 10 мм приготовленного раствора и переносят в пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см , добавляют 1 см деионизированной воды и перемешивают. Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °С - не более 1 мес.
6.1.9 Приготовление смеси нуклеотидов концентрацией =4 ммоль/дм
=4 ммоль/дм В микроцентрифужную пробирку вместимостью 0,2 см вносят 96 мм деионизированной воды, 1 мм АТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [22], 1 мм ГТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [24], 1 мм ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [23], 1 мм ТТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [25], смесь перемешивают.
вносят 96 мм деионизированной воды, 1 мм АТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [22], 1 мм ГТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [24], 1 мм ЦТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [23], 1 мм ТТФ (концентрацией 100 ммоль/дм ) по 4.43, [25], смесь перемешивают. Срок хранения при температуре минус 20 °С - не более одного года.
6.1.10 Приготовление 1xTBE буфера для электрофореза
В мерную колбу вместимостью 1000 см вносят 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения.
вносят 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты по ГОСТ 9656 и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, доводят дистиллированной водой до метки, перемешивают до полного растворения. Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.
6.1.11 Приготовление раствора концентрацией (C
H
N
Br)=10 мг/см
(C H N Br)=10 мг/см В мерную колбу вместимостью 100 см помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой.
помещают 1 г бромистого этидия по 4.35, [14], растворяют и доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 12 мес.
6.1.12 Приготовление 2%-ного агарозного геля
6.1.12.1 В плоскодонную стеклянную колбу вместимостью не менее 200 см помещают 1 г агарозы по 4.39, [18], добавляют 50 см буфера 1xTBE, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °С и кипятят до полного расплавления агарозы.
помещают 1 г агарозы по 4.39, [18], добавляют 50 см буфера 1xTBE, приготовленного по 6.1.10, тщательно перемешивают взбалтыванием. Колбу со смесью нагревают в микроволновой печи по 4.10 или на водяной бане при температуре 100 °С и кипятят до полного расплавления агарозы. 6.1.12.2 Расплавленную агарозу, приготовленную по 6.1.12.1, охлаждают при комнатной температуре до 50 °С, автоматическим микродозатором добавляют 5 мм раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями.
раствора бромистого этидия, приготовленного по 6.1.11, тщательно перемешивают круговыми движениями. 6.1.12.3 Однородную смесь, полученную по 6.1.12.2, разливают в кюветы для электрофореза и с помощью гребенки формируют карманы. Через 15-30 мин после остывания геля гребенку удаляют.
Допускается хранение геля в 1xTBE буфере для электрофореза, приготовленного по 6.1.10, в холодильнике при температуре от 4 °С до 5 °С - не более 7 сут.
6.2 Подготовка пробы
6.2.1 Две навески анализируемого продукта, навеску стандартного образца состава генетически не модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0) пo 4.41, [20] и навеску стандартного образца состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5) пo 4.42, [21] массой от 70 до 80 мг каждая помещают в четыре микроцентрифужные пробирки типа Эппендорф вместимостью 1,5 см . С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".
. С помощью дозатора добавляют в каждую по 200 мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом по 6.1.5 и немедленно тефлоновым пестиком растирают смесь до получения однородной массы. В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 600 мм лизирующего буфера с меркаптоэтанолом. Смесь тщательно перемешивают тефлоновым пестиком, не допуская образования комков. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа "Вортекс". 6.2.2 Приготовленные по 6.2.1 смеси помещают в термостат, инкубируют при температуре 65 °С 40-60 мин, после чего повторно перемешивают 30 с на аппарате для встряхивания и центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф по 4.7, [5] при частоте вращения 12000-13000 мин
.
. 6.2.3 Надосадочную жидкость приготовленных по 6.2.2 смесей переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см , не захватывая частицы суспензии из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 400 мм хлороформа, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии. Полученные суспензии центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин при комнатной температуре.
, не захватывая частицы суспензии из осадка. Затем в каждую микроцентрифужную пробирку добавляют по 400 мм хлороформа, приготовленного по 6.1.6, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии. Полученные суспензии центрифугируют 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 12000 мин при комнатной температуре. 6.2.4 Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.3, из четырех пробирок переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см , не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды.
, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом и центрифугирование по 6.2.3 повторяют дважды. 6.2.5 Верхние слои (водные фазы), приготовленные по 6.2.4, переносят в четыре чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 см , добавляют в каждую из них по 600 мм изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °С, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с.
, добавляют в каждую из них по 600 мм изопропилового спирта по 4.28, [10], предварительно охлажденного в морозильной камере до температуры минус 20 °С, и перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с. Полученные смеси помещают в морозильную камеру температурой минус 20 °С не менее чем на 30 мин для образования осадка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
На данном этапе допускается хранение полученных смесей до 12 ч в морозильной камере при температуре минус 20 °С.
6.2.6 Смеси, приготовленные по 6.2.5, центрифугируют 6 мин при частоте вращения 12000 мин при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый осадок 2-3 раза промывают 200 мм 70%-ного этилового ректификованного спирта, приготовленного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15-20 с и центрифугируя их на микроцентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин . Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.
при комнатной температуре. Аккуратно удаляют надосадочную жидкость. Каждый осадок 2-3 раза промывают 200 мм 70%-ного этилового ректификованного спирта, приготовленного по 6.1.7, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15-20 с и центрифугируя их на микроцентрифуге 6 мин при частоте вращения 12000 мин . Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.