Методические указания МУК 4.2.1068-01 "Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 20 сентября 2001 г.)
Дата введения: с момента утверждения
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 
воздуха.
воздуха. Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе производственных помещений биотехнологических производств и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.
2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 и его гигиенический норматив
Систематическое положение штамма-продуцента
| Порядок | Actinomycetales |
| Класс | Actinomycetes |
| Семейство | Streptomycetaceae |
| Род | Streptomyces |
| Вид | fradiae |
| Штамм | БС-1 |
Культурально-морфологические особенности штамма
Штамм Streptomyces fradiae БС-1 является облигатным аэробом, растет на различных питательных средах: СР-6, СР-15, Гаузе-1, Ваксмана путем инкубирования в термостате при температуре 28°С. Продолжительность развития составляет 10-15 суток.
Четкие культурально-морфологические свойства штамма проявляются на агаризованной среде СР-15 на 3 день развития. На этой среде штамм образует 6 морфологических типов колоний, из которых наиболее характерный тип составляет более 70%. Изучаемый штамм представлен округлыми колониями до 9 мм в диаметре (в зависимости от плотности посева). Белый воздушный мицелий образуется в центре колонии и по периферии в виде одной, реже двух концентрических окружностей, край колоний не опушен. Профиль изогнутый, поверхность шероховатая, неопушенные части колоний гладкие, блестящие, кремовые. Структура мелкозернистая, по краю неопушенной части однородная. Консистенция плотная, пигмент с обратной стороны колоний желтовато-коричневый.
Предельно допустимая концентрация Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны - 2000 
, пометка А, 3 класс опасности.
, пометка А, 3 класс опасности.3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента тилозина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 
при доверительной вероятности 0,95.
при доверительной вероятности 0,95.4. Метод измерений
Метод измерения концентрации штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 основан на аспирации аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков мицелия) на поверхность плотной питательной среды СР-15 и подсчета выросших колоний, которые выявляются при задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis), происходящего вследствие диффузии в агар антибиотика, выделяемого штаммом-продуцентом Streptomyces fradiae БС-1.
При данном методе на чашке Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т. к. большее количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что приводит к занижению результатов.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
| Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) | ТУ 64-12791-77 |
| Термостаты электрические суховоздушные или водяные | |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Бокс, оборудованный бактерицидными лампами | |
| Холодильник бытовой | |
| Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 | |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 | |
| Водяная баня или водяной термостат | |
| Газовая горелка или спиртовка лабораторная | |
| Чашки Петри | |
| Петли бактериологические | |
| Пробирки биологические, вместимостью 20 и 35 мл | ГОСТ 10515-75 |
| Пипетки мерные на 1,5 и 10 мл | ГОСТ 10515-75 |
| Пипетки мерные на 1,5, и 10 мл | ГОСТ 1770-74 |
| Колбы конические, вместимостью 250 и 500 мл | ГОСТ 1770-74 |
| Секундомер | ГОСТ 9586-75 |
| Барометр | ГОСТ 24696-79 |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556-81 |
5.2. Реактивы, растворы
Среда СР-15, агаризованная питательная среда для продуцента тилозина (состав в %: меласса - 0,5, крахмал - 0,5, соевая мука - 0,5, кукурузный экстракт - 0,5,  - 0,1, NaCl - 0,1,   - 0,05,  - 0,2, агар - 1,5.рН среды до стерилизации 7,0 - 7,2. Режим стерилизации 1,1 - 1,2 атм., 40-50 мин)Агаризованная среда Хоттингера, рН 6,8 - 7,0 | |
| Спирт этиловый ректификат | ГОСТ 5962-67 |
| Хлороформ | |
| Тетрациклина гидрохлорид | |
Амфотерицин В для внутривенного введенияТест-культура Вас. subtilis вариант  музейный штамм, споры хранят в виде водной суспензии при температуре 4°С. |
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей зоны соблюдают:
- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;
- правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации приборов;
- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);
- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
7. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях в соответствии с ГОСТ 15150-69 при температуре воздуха (
)°С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
)°С, атмосферном давлении 630-800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.9. Проведение измерений
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации Streptomyces fradiae БС-1 воздух производственных помещений аспирируют со скоростью 10 л/мин на поверхность плотной питательной среды СР-15 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.
Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижный диск устанавливают чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку прибора закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В период отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или других стерильных емкостях.
Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны.
Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора.
9.2. Выполнение анализа
Агаризованную среду СР-15 расплавляют и остужают до 50 - 60°С. Затем добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при 37°С на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.
После отбора проб воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при температуре 28-30°С на 48 ч.
После инкубации чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл хлороформа, чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы выросшие колонии бактерий находились в парах хлороформа не менее 20 - 30 мин. Затем каждую чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 ч при комнатной температуре для преддиффузии.
Затем чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера с тест-культурой Вас. subtilis вариант 
из расчета 
споровых клеток на 1 мл среды (Государственная фармакопея СССР, изд. XI, 1989, с. 206).
из расчета споровых клеток на 1 мл среды (Государственная фармакопея СССР, изд. XI, 1989, с. 206). Чашки Петри с застывшей средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37°С на сутки. По окончании инкубации, т. е. через 3 суток после отбора пробы воздуха производят подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших клеток штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1. Учитывают зоны диаметром не менее 5 мм.
10. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации микробных клеток Streptomyces fradiae БС-1 в 1 
воздуха производят по формуле:
воздуха производят по формуле: