Методические указания МУК 4.2.1902-04 "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 6 марта 2004 г.)
Дата введения: с момента утверждения
1. Введение
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации ГМИ растительного происхождения в пищевой продукции.
1.2. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющей контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья.
1.3. Методические указания являются обязательными при контроле пищевых продуктов на наличие генетически модифицированных источников и применяются на этапах поставки на производство, гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза в страну и реализации.
1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого методического подхода для идентификации генетически модифицированных источников в пищевых продуктах, продовольственном сырье, пищевых и биологически активных добавках к пище.
2. Область применения
Методические указания содержат описание методов определения ГМИ растительного происхождения в пищевых продуктах, основанных на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Описаны скрининговые методы, направленные на выявление регуляторных последовательностей: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens. Идентификация этих регуляторных последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевой продукции на наличие ГМИ, но не определяет примененную генетическую конструкцию или конкретную линию растения (трансформационное событие), а также не может применяться при проведении количественного анализа содержания ГМИ. Окончательная идентификация ГМИ, разрешенных для реализации населению и использованию в пищевой промышленности в Российской Федерации, проводится с применением протоколов исследований для конкретных трансформационных событий, которые представляются разработчиком в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России при проведении санитарно-эпидемиологической экспертизы. В методических указаниях описаны методы идентификации генетических конструкций для наиболее часто встречаемых на мировом и внутреннем продовольственных рынках генетически модифицированных растений.
Методы, применяемые при отборе проб пищевых продуктов, выделения ДНК для проведения анализов, проведения электрофореза, документирования и анализа получаемых данных, а также вопросы организации рабочего места, являются обязательными к исполнению при проведении как скрининговых, так и идентификационных анализов.
С целью выявления наличия сои и кукурузы как традиционных, так и генно-модифицированных сортов в исследуемом пищевом продукте, а также проверки качества выделяемых из исследуемых образцов препаратов ДНК приведены методы идентификации последовательностей ДНК, специфичных для всех линий сои и кукурузы.
Все представленные методы являются качественными и состоят из следующих этапов: выделение ДНК из пищевого продукта, амплификация целевой ДНК с соответствующими праймерами, электрофорез продуктов амплификации в агарозном геле, документирование и анализ результатов.
3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы
3.1. Аппаратура и инструменты
| Амплификатор типа "Терцик МС-2" со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5°С/с | |||
| Прибор для горизонтального электрофореза типа "Mini-Sub Cell GT System" с комплектом кювет и гребенок | |||
| Источник напряжения типа "Power Рас 300" с диапазоном регулируемого напряжения 50-300 В | |||
| Видеосистема типа "Gel Doc 2000_", предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминисцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием: диапазон излучения 300-400 нм, чувствительность - не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию) | |||
| Холодильник бытовой электрический | ГОСТ 26678 | ||
| Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20°С | |||
| Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13 000 мин(-1) | |||
| Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120°С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2°С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5°С | |||
| Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 мин(-1) | |||
| Печь микроволновая (мощностью не менее 400 W) | |||
| Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г | ГОСТ 24104 | ||
| Анализатор потенциометрический, погрешность измерений рН +- 0,01 | ГОСТ 19881-74 | ||
| Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные | ГОСТ 19569-89Е | ||
| Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды | ГОСТ 6709-72 | ||
| Гомогенизатор перистальтического типа "Стомайкер" или других моделей | |||
| Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов | ТУ 16-535-84 | ||
| Дозаторы с переменным объемом дозирования: | |||
| 0,2-2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +- 1,2%; | |||
| 0,5-10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +- 0,8%; | |||
| 2-20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +- 0,8%; | |||
| 20-200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +- 0,6%; | |||
| 100-1 000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +- 3%; | |||
| 2-10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью +- 0,5%. | |||
| Пинцет медицинский | ГОСТ 21241-89 | ||
Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с техническими характеристиками, не хуже указанных выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенных для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Воронки стеклянные | ГОСТ 25336-82 |
| Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1 000 мл | ГОСТ 12738-77 |
| Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1 000 мл | ГОСТ 1770-74 |
| Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф, вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл | |
| Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до: 10; 20; 200; 1 000 мм3; 10 см3 |
3.3. Реактивы
| Кислота соляная, хч | ГОСТ 3118-77 | ||
| Кислота борная, хч | ГОСТ 9656-75 | ||
| Натрия гидроокись, чда | ГОСТ 4328-77 | ||
| Натрий хлористый, хч | ГОСТ 4233-77 | ||
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч | ТУ 6-09-11-1721-83 | ||
| Гексадецилтриметиламмониум бромид (СТАВ). | |||
| Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 5882 | |||
| Трис (оксиметил) аминометан, хч | ТУ 6-09-4292-76 | ||
| Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА).Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287 | |||
| Этидий бромистый, хч | ТУ 6-09-13-452-75 | ||
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-00 | ||
| Спирт изопропиловый, хч | ТУ 6-09-402-85 | ||
| Масло вазелиновое медицинское | ГОСТ 3164-78 | ||
| Хлороформ, хч ГОСТ 20015-88 | |||
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709-72 | ||
| Вода деионизированная | ОСТ 11.029.003-80 | ||
| 2-меркаптоэтанол, хч | ТУ 6-09-08-1024-81 | ||
| Термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70-72°С. Корпорация | |||
| "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 1806 | |||
| Буфер для ПЦР с MgCl2. Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 2192 | |||
| Агароза для электрофореза (тип П). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N А. 6877 | |||
| Маркер молекулярной массы ДНК. Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 1473 | |||
| Стандартный образец состава генетически немодифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-0). Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 53198 | |||
| Стандартный образец состава генетически модифицированного источника пищи растительного происхождения (Certified Reference Material IRMM N 410R SB-5). Корпорация "Сигма Алдрич" (Fluka), кат. N 44386 | |||
| Нуклеотиды: | |||
| - 2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4788 | |||
| - 2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4913 | |||
| - 2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 5038 | |||
| - 2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 9656 | |||
| Праймеры на промотор 35S, терминатор NOS, сою линии 40-3-2, кукурузу линий MON 810 и Bt-176, ген cry III (картофель), ген лектина (соя), ген зеина (кукуруза). ЗАО "Синтол" (Россия) http://www.syntol.ru | |||
Допускается использование других реактивов с техническими характеристиками, не хуже указанных выше, препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9 000 или EN 29 000.
4. Подготовка к анализу
4.1. Приготовление растворов
Приготовление 1 М ТРИС-НСl (рН 7,5)
В мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г Трис (оксиметил) аминометана (молекулярный вес 121) в 80 мл дистиллированной воды, довести рН концентрированной соляной кислотой до 7,5, затем довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20°С не более года.
Приготовление 5 М NaCl
Растворить 29,22 г натрия хлористого (молекулярный вес 58,5) в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовление 30%-ной NaOH
Растворить 3 г натрия гидроокиси (молекулярный вес 40) в 7 мл дистиллированной воды.
Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)
В мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 мл дистиллированной воды. Раствором 30%-ной натрия гидроокиси довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.
Приготовленные растворы автоклавировать при 1 атм., 121°С 15-20 мин или фильтровать через мембраны Millipore 0,4 мкм.
Приготовление хлороформа, насыщенного водой
Смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения. Срок хранения при температуре от 4 до 5°С - не более 6 мес.
Приготовление 70%-ного раствора этилового ректификованного спирта
Смешать 70 мл 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 мл деионизированной воды. Срок хранения при температуре от 4 до 5°С - не более 2 мес.
Приготовление раствора БСА (20мкг/мл)
Растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды.
Срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20°С - не более 6 мес.
Приготовление лизирующего буфера (2%-ного "СТАВ")
Растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды (при плохом растворении подогреть на водяной бане), добавить 2,5 мл 1 М Трис - НСl, 7 мл 5 М NaC, 1 мл 0,5 М ЭДТА, доводят объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешивают. Срок хранения при температуре от 4 до 5°С - не более 6 мес, допустимо образование осадка.
Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65°С до полного растворения осадка.
Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят меркаптоэтанол из расчета 4 мм3 на 1 см3 лизирующего буфера и перемешивают.
При проведении электрофореза использовать один из нижеперечисленных буферов
Приготовление 1 x TBE буфера для электрофореза
В мерной колбе на 1 000 мл растворить 10,8 г Трис (оксиметил) аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения. Срок хранения 1х раствора - 10 дней, обычно готовят 10 х и перед употреблением разбавляют до 1х, используют максимум три раза.
Приготовление 1 x ТАЕ буфера для электрофореза
В мерную колбу вместимостью 1 000 мл внести 242 г Трис-основания, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5 М ЭДТА, долить деионизованной водой до метки. Полученный 50х раствор перед употреблением развести в 50 раз. Использовать для проведения электрофореза не более двух раз.