Приготовление раствора бромистого этидия - C21Н20N3Br (10 мг/мл)
Растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды. Срок хранения в посуде темного стекла - обязательно при температуре от 4 до 5°С - не более 12 мес.
Приготовление 2%-ного агарозного геля см. п. 8
Допускается хранение готового геля в 1х буфере для электрофореза в холодильнике при температуре от 4 до 5°С - не более 2 сут.
5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа
Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-00, 10852-86, 12430-66, 13979-86, 26313-84, 22617.0-77, 27668-88, 26312.1-84, 9792-73, 7631-85, 12036-85, 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, 19341-73, 26809-86, 27668-88, 27853-88, 28741-90, 29142-91, 13634-90, 15877-70, 17110-71, 17109-88, ГОСТ Р 50436-92, 50437-92, 51926-02, ГОСТ Р ИСО 2170-97.
6. Проведение анализа. Выделение ДНК
6.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид)
Подготовка пробы (раствора ДНК).
- Навеску исследуемого продукта массой 70-80 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
- Добавить 200 мкл - лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, тщательно растереть пробу в пробирке пестиком
- Добавить еще 600 мкл лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".
- Инкубировать при 65°С 40-60 мин, перемешать на аппарате для встряхивания, центрифугировать 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13 000 об./мин.
- Перенести супернатант в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.
- Добавить 400 мкл хлороформа, предварительно насыщенного водой.
- Перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до образования суспензии.
- Центрифугировать 7 мин при частоте вращения 12 000 об./мин.
- Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом повторить.
- Центрифугировать 7 мин при частоте вращения 12 000 об./мин.
- Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа.
- Добавить 600 мкл изопропилового спирта, взятого из морозильной камеры (минус 20°С), перемешать.
- Поместить пробирку в морозильную камеру (минус 20°С) на 30 мин, не менее. В морозильной камере можно оставить на ночь.
- Центрифугировать 6 мин при частоте вращения 12 000 об./мин.
- Тщательно удалить верхний слой.
- Осадок промыть 200 мкл 70%-ного этилового спирта (2-3 раза), каждый раз перемешивая на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугировать 6 мин при частоте вращения 12 000 об./мин (суспендированный в 70%-ном этаноле образец можно оставить на ночь в морозильной камере при минус 20°С).
- Последний раз тщательно до последней капли удалить спирт.
- Подсушить осадок 5 мин при 65°С для удаления капель спирта.
- Растворить осадок в 50 - 100 мкл деионизированной воды, осторожно встряхивая.
- Полученный раствор ДНК готов для проведения ПЦР, хранить при минус 20°С (допустимо неполное растворение осадка).
7. Амплификация
Общие требования к постановке идентификационной ПЦР.
При проведении идентификации ГМИ обязательно готовят следующие пробы:
- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к соответствующей трансгенной конструкции;
- ДНК-матрица положительного контроля с праймерами к специфичному для вида пищевого продукта гену (лектин - для сои; зеин - для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к соответствующей трансгенной конструкции;
- ДНК-матрица отрицательного контроля с праймерами к специфичному для вида пищевого продукта гену (лектин - для сои; зеин - для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- исследуемые образцы ДНК пищевого продукта с праймерами к соответствующей трансгенной конструкции;
- исследуемые образцы ДНК пищевого продукта с праймерами к специфичному для вида пищевого зерна гену (лектин - для сои; зеин - для кукурузы; фосфоенолпируват карбоксилазы - для картофеля);
- безматричные контроля ПЦР для всех праймерных систем, участвующих в анализе.
7.1. Метод идентификации промотора 35S [1]
Праймеры для идентификации промотора 35S:
1 - GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А
2 - GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 1.
Таблица 1
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 169 мкл | 338 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10х) | 29 мкл | 58 мкл |
3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29 мкл | 58 мкл |
4 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14 мкл | 28 мкл |
5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.