- В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 2.
Таблица 2
| Стадия | Тип амплификатора* | |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4 | Trio | |
| Денатурация | 3 мин/94°С | 3 мин/94°С |
20 с/94°С | 30 с/95°С | |
| Амплификация | 40 с/54°С | 40 с/54°С |
60 с/72°С | 40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 | 40 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С |
| Скорость нагрева | 0,77°С/с | 1°С/с |
| Скорость остывания | 3,15°С/с | 1°С/с |
| *В табл. 2 указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | ||
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле. Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 195 пар нуклеотидов, прилож. 1.
7.2. Метод идентификации терминатора NOS [1]
Праймеры для идентификации терминатора NOS:
1 - GAA ТСС TGT TGC CGG TCT TG
2 - ТТА ТСС TAG ТТТ GCG CGC ТА
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 3.
Таблица 3
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 169 мкл | 338 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10x) | 29 мкл | 58 мкл |
3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29 мкл | 58 мкл |
4 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14 мкл | 28 мкл |
5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 4.
Таблица 4
Стадия | Тип амплификатора* | |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4 | Trio | |
| Денатурация | 3 мин/94°С | 3 мин/94°С |
20 с/94°С ' | 30 с/95°С | |
| Амплификация | 40 с/54°С | 40 с/54°С |
60 с/72°С | 40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 | 40 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 1 мин/4°С | 1 мин/4°С |
| Скорость нагрева | 0,77°С/с | 1°С/с |
| Скорость остывания | 3,15°С/с | 1°С/с |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | ||
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле. Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 180 пар нуклеотидов, прилож. 2.
7.3. Метод идентификации сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату [2]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации
Первый раунд. Оба раунда проводятся в течение одного рабочего дня.
Внешние праймеры:
1 - CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG
2 - CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 5.
Таблица 5
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10 х) | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 6.
Таблица 6
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 3 мин/ 95°С |
30 с/95°С | |
| Амплификация | 30 с/60°С |
40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 25 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.