Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации после 1-го раунда.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 12.
Таблица 12
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Ttio | |
| Денатурация | 3 мин/95°С |
45 с/95°С | |
| Амплификация | 50 с/60°С |
50 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 149 пар нуклеотидов, прилож. 4.
7.5. Метод идентификации кукурузы линии Bt-176, устойчивой к стеблевому мотыльку [4]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации.
Первый раунд. Внешние праймеры:
1 - CGG ССС CGA GTT САС СТТ
2 - CTG CTG GGG ATG ATG TTG TTG
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 13.
Таблица 13
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | 2 | 3 | 4 |
1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10 х) | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 14.
Таблица 14
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 3 мин/ 95°С |
40 с/95°С | |
| Амплификация | 40 с/60°С |
40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 25 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
3 - CCG САС ССТ GAG CAG САС
4 - GGT GGC ACG TTG TTG TTC TGA
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 15.
Таблица 15
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10x) | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации после 1-го раунда.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).