- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 16.
Таблица 16
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ- 4, Trio | |
| Денатурация | 3 мин/ 95°С |
40 с/95°С | |
| Амплификация | 40 с/60°С |
40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 35 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 189 пар нуклеотидов, прилож. 5.
7.6. Идентификация картофеля, устойчивого к колорадскому жуку (ген cry III A) [5]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации.
Первый раунд. Внешние праймеры:
1 - СТА ССА СТА AGG ATG ТТА ТСС
2 - ATG CAC TCA CGT AGT ССТ СС
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 17.
Таблица 17
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 161,3 мкл | 322,6 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10 х) | 33 мкл | 66 мкл |
3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33 мкл | 66 мкл |
4 | Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 мкл | 12,4 мкл |
5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 18.
Таблица 18
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 2 мин/98°С |
30 с/95°С | |
| Амплификация | 30 с/60°С |
40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 20 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
Второй раунд.
Внутренние праймеры:
1 - СТА ССА СТА AGG ATG ТТА ТСС
3 - TTG TAT AGA AGC ТС A CGA GG
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 19.
Таблица 19
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 164,8 мкл | 329,6 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10 х) | 33 мкл | 66 мкл |
3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 33 мкл | 66 мкл |
4 | Смесь нуклеотидов (10 млМ) | 6,2 мкл | 12,4 мкл |
5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 2,5 мкл | 5,0 мкл |
7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл продукта амплификации после 1-го раунда.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла
Условия амплификации представлены в табл. 20.
Таблица 20
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2400; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 2 мин/ 98°С |
30 с/95°С | |
| Амплификация | 30 с/60°С |
40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.