1 - GTC ТСС TTG GCT С AT TTT АТС С
2 - САА GTT AGC TGC CAT TCT GGC С
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 25.
Таблица 25
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
| N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 188,7 мкл | 377,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10 х) | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 26.
Таблица 26
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 3 мин/95°С |
1 мин/94°С | |
| Амплификация | 1 мин/60°С |
1 мин/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 |
| Конечное удлинение | 7 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 1 149 пар нуклеотидов.
8. Проведение электрофореза в агарозном геле
Приготовление агарозного геля
- Для приготовления 2%-ной агарозы необходимо к 1 г агарозы добавить 50 мл 1х буфера ТВЕ и тщательно перемешать.
- Полученный раствор поместить в микроволновую печь (на 2-5 мин, в зависимости от мощности печи - следить за интенсивностью кипения суспензии!!) или прокипятить на водяной бане 15 мин до полного растворения агарозы.
- Расплавленную агарозу охладить до 56°С и добавить 5 мкл бромистого этидия (концентрация 10 мг/мл), тщательно перемешать.
- Расплавленную агарозу с бромистым этидием разлить в подготовленную форму. Толщина геля 0,5-0,7 см.
- Через 30-40 мин удалить гребенку. Готовый гель можно использовать сразу, можно хранить в 1х буфере в холодильнике при 4°С.
Проведение электрофореза
- Смешать в отдельной пробирке 2 мкл буфера для нанесения и 10 мкл реакционной смеси. Внести смесь в лунки геля. (Можно использовать соотношение буфер/реакционная смесь - 2/8.) В одну из лунок (чаще в крайнюю) внести маркер молекулярной массы (можно 100 Вр).
- Поместить заполненный гель в камеру для электрофореза, заполненную буфером 1х ТБЕ. Толщина слоя буфера над поверхностью геля ~ 2-3 мм.
- В режиме постоянного напряжения 100 V электрофорез длится примерно 70-90 мин.
- Гель (без формы) поместить на фильтр трансиллюминатора и посмотреть в проходящем ультрафиолетовом свете.
- Документировать результат фореза - либо на фотопленку "Микрат Изопан" (изопанхроматическая фотопленка чувствительностью 3 ед. ГОСТ, фотографическая широта 10, разрешение - 300 линий/мм), либо при помощи гельдокументирующей системы. Фотокопия геля должна быть приложена к отчету по идентификации (при цифровой съемке - распечатывается на принтере с разрешением не менее 300dpi).
9. Источники появления ложных положительных сигналов при проведении ПЦР-диагностики и их предотвращение [6]
Наиболее мощные источники загрязнений (в порядке вклада):
- загрязнение продуктами предыдущих реакций;
- плазмиды, фаги, космиды и прочие векторы, особенно если они используются в качестве зондов при гибридизации;
- положительный контроль (клонированная ДНК или сырье);
- перекрестное загрязнение образцов;
- загрязнение из других источников при взятии образцов (возможно даже загрязнение от перчаток);
- загрязнение препарата полимеразы бактериальной ДНК (важно при получении ПЦР продуктов консервативных областей генов 16S рРНК, к примеру).
Стадии анализа | Источники загрязнений | |
| Окружающая среда | Источник материала | Ошибки при выборе источника |
| Сбор образцов | Посуда, шпатели, перчатки | |
| Фиксация образцов | Загрязненные реактивы для фиксации | |
Транспортирование образцов | Техника, резервуары | |
| Лаборатория | Приготовление образцов | Ошибки персонала, загрязнение положительным контролем (материалом) |
| Выделение ДНК | Загрязнения продуктами предыдущих ПЦР | |
| Постановка ПЦР | Положительные контроли, векторы, реактивы | |
| Анализ продуктов ПЦР | Ошибки персонала | |
Применение более чувствительных методик проведения ПЦР (таких как Hot-Start, nested-PCR) существенно повышает чувствительность ПЦР к посторонним загрязнениям.
Следует отметить, что хотя большинство причин ложных положительных сигналов (ЛПС) являются следствием внутрилабораторных причин, не стоит сбрасывать со счетов и загрязнения, происходящие вне лаборатории - во время сбора образцов, их первичной обработки (фасовка, упаковка, транспортирование), поскольку именно на этой стадии наиболее сложно обеспечить стерильные условия работы.
Для повышения точности анализа необходимо постоянно использовать в работе отрицательные контроли, эксперименты должны выполняться не менее, чем в двух повторностях (исследовать от одного образца продукта сразу две пробы). В случае получения постоянных положительных сигналов на отрицательных контролях все исходные реактивы подлежат немедленной замене.
Возможные причины возникновения ЛПС, не связанные с внешними источниками:
- наличие амплифицируемой ДНК при проведении ПЦР с обратной транскрипцией (важно при определении вироида и РНК-содержащих вирусов);
- амплифицирование сходных последовательностей, с которыми связываются праймеры - псевдогенов и гомологов (здесь важен этап конструирования праймеров);
- неспецифическая амплификация (правильный подбор условий проведения ПЦР).