Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 102 пары нуклеотидов, прилож. 6.
7.7. Идентификация ДНК сои: ген лектина [2]
Праймеры:
1 - GCC СТС ТАС ТСС АСС ССС АТС С
2 - GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 21.
Таблица 21
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10х) | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использования амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 22.
Таблица 22
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 3 мин/95°С |
30 с/95°С | |
| Амплификация | 30 с/60°С |
40 с/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 |
| Конечное удлинение | 3 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 118 пар нуклеотидов, прилож. 7.
7.8. Идентификация ДНК кукурузы: ген зеина [3]
Праймеры:
1 - TGC TTG CAT TGT TCG СТС ТСС TAG
2 - GTC GCA GTG АСА TTG TGG CAT
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл. 23.
Таблица 23
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 193,7 мкл | 387,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl2 (10x) | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3 000 об./мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.,
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3 000 об./мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл. 24.
Таблица 24
Стадия | Тип амплификатора* |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4, Trio | |
| Денатурация | 3 мин/95°С |
1 мин/94°С | |
| Амплификация | 1 мин/60°С |
1 мин/72°С | |
| Количество циклов амплификации | 40 |
| Конечное удлинение | 7 мин/72°С |
| Фаза остывания | 4°С |
| * В таблице указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | |
После проведения амплификации пробы поместить на холод.
Хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда.
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле.
Схема проведения электрофореза п. 8.
Продукт амплификации - 329 пар нуклеотидов, прилож. 8.
7.9. Идентификация ДНК картофеля: ген фосфоенолпируват карбоксилазы
Праймеры: