Техника окраски
Готовят рабочее разведение ФА на ФБР в соответствии с указанием на этикетке (срок хранения - не более 2 недель при +4°С). Предметные стакла с фиксированными мазками помещают во влажную камеру, на нижний мазок наносят каплю флуоресцирующего иммуноглобулина в рабочем разведении.
Стекла с мазками обрабатывают ФА в течение 30 мин при комнатной температуре (18-22°С) или в течение 20 мин при 37°С во влажной камере. Затем препараты вынимают, стряхивают с них капли ФА, споласкивают стекла в дистиллированной воде и помещают в сосуд с ФБР для промывания мазков (2 раза по 10-15 мин при комнатной температуре). Далее препараты споласкивают дистиллированной водой и высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре под вентилятором.
Учет результатов
Мазки просматривают с масляной иммерсией, обращая внимание на число и тип клеток, уровень их свечения, наличие флуоресцирующих включений. В препаратах из носовой полости человека наиболее часто встречаются клетки цилиндрического эпителия, плоские эпителиальные клетки, лейкоциты. Диагностическое значение имеет выявление специфического свечения в клетках цилиндрического эпителия, имеющих бокаловидную форму или округлую форму с относительно крупным ядром и малой цитоплазматической зоной. Мелкие лейкоциты и крупные полигональные клетки с мелким ядром (плоского эпителия) при диагностике во внимание не принимаются. Следует учитывать результаты микроскопии только тех мазков, в которых содержится не менее 15 клеток цилиндрического эпителия. Интенсивность свечения клеток оценивают по общепринятой четырехкрестовой шкале. Свечение в клетках чаще всего локализуется в цитоплазме, хотя с ФА к гриппу и аденовирусам можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток. Диагностически доказательным является обнаружение не менее 3 клеток цилиндрического эпителия с отчетливо видимым зеленоватым специфическим свечением, яркость которого оценивается на один крест и более.
2.2. Иммуноферментный метод индикации вирусных антигенов (ИФА)
Используются для ранней дифференциальной диагностики гриппа типа А или В путем выявления вирусных антигенов в носоглоточных секретах (аспираты, смывы) от больных с симптомами ОРЗ. Преимуществом ИФА перед МИФ является его высокая чувствительность, возможность одновременного анализа большого числа клинических материалов, объективный количественный учет результатов.
Метод может быть использован для мониторинга инфекционного и вакцинального процесса, для изучения острых и хронических форм вирусных инфекций, расшифровки природы эпидемических вспышек и индивидуальной диагностики.
Способ применения
Подготовка материала для исследования. Материалом для исследования служит отделяемое носовой полости у больных с симптомами ОРЗ, которое получают путем аспирации секретов с помощью устройства для забора жидкости, подсоединяемого к вакуумному насосу. Секреты перед исследованием разводят в 5 раз ФСБ с 0,05% твина-20. Допустимо использование носоглоточных смывов или мазков из области нижних носовых ходов, мягких соскобов с трахеи (в условиях специализированных клиник). В этом случае слизь и клеточное содержимое, снятые ватными тампонами, ресуспендируют в 2 мл ФСБ, содержащего 0,05% твина-20. Материалы от больных перед исследованием подвергают двукратному замораживанию-оттаиванию для высвобождения клеточных антигенов. Их можно хранить в течение 3-4 мес. при температуре от -15 до -25 °С.
Материалы и оборудование: планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения, многоканальный спектрофотометр отечественного (АИФ-Ц-01С) или зарубежного производства (мультискан), регулируемые микропипетки одноканальные на 10-50 мкл и на 50-250 мкл, а также 8-канальные - на 50-250 мкл, устройство для забора жидкости однократного применения, электроотсос, ионометр, термостат, низкотемпературный прилавок, бытовой холодильник, лабораторная центрифуга, пробирки, мерные пипетки, иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов вирусов гриппа типа А или В (ИФТС "Грипп-виротест").
Состав ИФТС "Грипп-виротест":
1. Антитела к вирусу гриппа типа А (или В) - 1 амп.
2. Положительный контрольный образец вируса гриппа (К+) - 1 амп.
3. Отрицательный контрольный образец вируса гриппа гетерологичного типа), (К-) - 1 амп.
4. Антитела к вирусу гриппа, меченные пероксидазой хрена (Кон) - 1 амп.
5. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) - 1 фл.
6. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) - 1 фл.
7. Натрий хлористый - 1 фл.
8. Смесь желатина с сахарозой - 2 фл.
9. Твин - 20 - 1 фл.
10. Натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 фл.
11. Кислота лимонная - 1 фл.
12. Ортофенилендиамин - 1 фл.
13. Перекись водорода (3% раствор) - 1 фл.
14. Кислота серная (1 моль/л) - 1 фл.
15. Планшет для ИФА - 2 шт.
Приготовление растворов:
Раствор 1. Содержимое флакона N5 (32 мг натрия углекислого и 58,4 мг натрия углекислого кислого) растворяют в 20 мл дистиллированной воды.
Раствор 2. 53 мг желатины и 750 мг сахарозы растворяют в 1 мл дистиллированной воды при температуре 55 °С. Содержимое 2-х флаконов (по 1,5 мл) объединяют.
Раствор 3. Содержимое флакона с ФСБ (712 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,136 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 4,25 г натрия хлористого) растворяют в 500 мл дистиллированной воды.
Раствор 4. К 500 мл раствора 3 добавляют 250 мкл твина-20.
Раствор 5. К 320 мл раствора 4 добавляют 6,64 г натрия хлористого.
Раствор 6. К 18 мл раствора 4 добавляют 3 мл раствора 2.
Раствор 7. 0,216 г натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 6 мл дистиллированной воды (раствор А), 0,126 г лимонной кислотной растворяют в 6 мл дистилированной воды (раствор В). Смешивают 5,1 раствора А и 4,9 мл раствора В, объем доводят до 20 мл дистиллированной водой (ЦФБ).
Раствор 8. 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл раствора 7, добавляют 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор 8 готовят непосредственно перед употреблением).
Раствор 9. Содержимое ампулы с антителами растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Затем препарат антител разводят с помощью раствора 1 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).
Раствор 10. Содержимое ампулы с антителами, меченными пероксидазой, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат конъюгата (Кон) доводят с помощью раствора 6 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).
Раствор 11. Содержимое ампулы с К+ растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К+ разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).
Раствор 12. Содержимое ампулы с К- растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат К- разводят с помощью раствора 4 до титра, указанного на этикетке (рабочее разведение).
Примечание: иммунореагенты тест-системы после их растворения хранить при температуре 4-8 °С не более 15 сут.
Проведение ИФА:
1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антител к вирусу гриппа в рабочем разведении.
2. Планшет закрывают крышкой и выдерживают при температуре 4-8 °С в течение (18+-2) ч.
3. По завершении адсорбции антител жидкость из лунок удаляют встряхиванием перевернутого планшета и постукиванием по фильтровальной бумаге. Лунки планшета при комнатной температуре промывают 3 раза по 0,2 мл раствора 4 и 1 раз - дистиллированной водой. Планшеты осушают.
4. В 8 краевых лунок первого ряда вносят по 100 мкл раствора 4.
5. Рабочие растворы К+ и К- вносят по 100 мкл в лунки второго ряда (по 2 лунки на каждый).
6. Исследуемые материалы от больных вносят по 100 мкл (в 2 лунки каждый).
7. Планшеты закрывают и выдерживают при температуре 4-6 °С в течение 18 ч.
8. Содержимое лунок удаляют, планшеты промывают 4 раза раствором 5 и 1 раз - дистиллированной водой.