9. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл Кон в рабочем разведении.
10. Планшеты закрывают и инкубируют 2 ч при температуре (20+-3)°С в течение 2 ч.
11. Планшеты промывают как указано в п.8.
12. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора 8.
13. Планшеты инкубируют 4-5 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте (до появления желтого окрашивания в лунках с К+).
14. Реакцию останавливают внесением в лунки по 50 мкл раствора серной кислоты.
Учет результатов
Результаты учитывают с помощью спектрофотометра (мультискана) зарубежного или отечественного производства (типа АИФ-Ц-01С) при длине волны 490 нм. По показаниям прибора рассчитывают среднюю величину оптической плотности (ОП490) раствора в контрольных лунках первого ряда (Мк). Значение Мк должно быть не выше, чем 0,07. Средняя величина ОП490 растворов в двух лунках с положительными контрольными образцами (М+) должна быть не ниже, чем 0,35, а отклонения значений ОП490 в дубликатах проб с К+ от М+ - не более 20%. Значения ОП490 раствора в лунках с К должны быть не выше, чем 0,1.
К числу положительных (содержащих вирус гриппа соответствующего типа) относят те из исследуемых проб, значения ОП490 по которым превышают значения Мк не менее, чем в 1,6 раза.
Предосторожности в работе
При работе с вируссодержащими материалами от больных все операции следует выполнять в масках, не допускается пипетирование ртом, все использованные материалы следует подвергать обработке хлорамином (3% раствор) в течение 18 ч. Необходимо избегать попадания раствора ортофенилендиамина на кожу и слизистые, в случае контакта - промыть большим количеством воды.
3. Серологические методы диагностики гриппа и других ОРЗ
Серологические реакции, такие как реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), иммуноферментный анализ (ИФА), используются для определения уровня специфических антител в сыворотках больных ОРЗ с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Эти методы используются также для определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек, оценки иммуногенной активности гриппозных вакцин.
3.1. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) для диагностики гриппа и парагриппозной инфекции
Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител.
Для проведения РТГА с гриппозными антителами используют диагностикумы из штаммов, резистентных к неспецифическим сывороточным ингибиторам. Перед постановкой реакции парные сыворотки крови от больных, взятые в острой фазе инфекции и в период реконвалесценции, разводят в 10 раз физиологическим раствором (ФР) и прогревают в водяной бане при 56 °С в течение 30 мин. При постановке РТГА с парагриппозными антигенами сыворотки необходимо дополнительно освобождать от неспецифических гемагглютининов. Для этого к сывороткам, разведенным в 10 раз, добавляют по 1 капле осадка эритроцитов морской свинки, смесь встряхивают и оставляют на ночь при температуре +4 °С. В работе используют надосадочную жидкость.
При проведении РТГА с вирусами гриппа используют эритроциты кур или человека 0(1) группы крови, с вирусами парагриппа - эритроциты морской свинки. Для получения эритроцитов морской свинки используют 2,5% раствор лимоннокислого натрия на ФР, который добавляют к цельной крови в соотношении 1:5, эритроцитов кур - раствор Альсевера (1:1), состоящий из глюкозы (2,05 г), хлористого натрия (0,42 г) и лимоннокислого натрия (0,8 г), разведенных в 100 мл дистиллированной воды. Эритроциты хранят при +4 °С до появления первых признаков гемолиза (в течение 1 недели). Перед постановкой опыта эритроциты кур и морских свинок отмывают ФР три раза, человека - 6 раз с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 15 мин. В реакции используют 1% суспензию эритроцитов.
В РТГА используют раствор антигена, содержащий 4 ГЕ/0,1 мл.
Предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) определяют титр антигена. Для этого вряду лунок планшета, содержащих по 0,1 мл ФР, готовят двукратные разведения антигена (начиная с 1:2 до титра, указанного на этикетке). После этого в каждую лунку вносят дополнительно по 0,1 мл ФР и 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Для контроля оседания эритроцитов в отсутствие антигена в дополнительном ряду смешивают по 0,2 мл ФР и 0,2 мл эритроцитов. Через 45-60 мин инкубации при температуре 20+-5°С при полном оседании эритроцитов в контрольном ряду учитывают результаты реакции.
Титром антигена считают его последнее разведение, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов.
Кратность разведения антигена для получения заданной дозы вируса определяют как частное от деления титра антигена на 4. В полученном растворе определяют правильность выбранной дозы повторным титрованием антигена с доведением ее (при несоответствии) до 4 ГЕ добавлением ФР или вирусного антигена. Дополнительно дозу вируса уточняют по результатам его взаимодействия со стандартной иммунной референс-сывороткой, которая должна в повторных опытах нейтрализовать 4 ГЕ в одном и том же разведении.
Парные сыворотки от больного исследуют в одном опыте. Готовят серию двукратных разведений сывороток на ФР (от 1:10 до 1:320) в объеме 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл (4 ГЕ) вируса. Панели встряхивают и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Результаты реакции учитывают после оседания эритроцитов в контрольных лунках (без вируса). Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, в котором наблюдается полное ингибирование гемагглютинации вируса. Диагностически достоверным считается не менее, чем 4-кратное увеличение титров антител в постинфекционной сыворотке по сравнению с сывороткой острой фазы заболевания.
3.2. Определение антител к вирусам гриппа и ОРЗ иммуноферментным методом
Использование иммуноферментного метода индикации антител к возбудителям острых респираторных вирусных инфекций обеспечивает ряд преимуществ перед традиционными тестами.
К ним относятся:
- высокая чувствительность тестов (титры выявляемых антител в сотни раз превышают регистрируемые в РТГА и РСК);
- специфичность анализа (на результат реакции не влияет присутствие неспецифических ингибиторов сывороток);
- повышенная (на 10-40%) частота распознавания вирусных ОРЗ при гриппе А, аденовирусной и РС-вирусной инфекциях;
- возможность дифференцированной индикации специфических антител классов IgG и IgM и распознавании тем самым острой фазы заболеваний, например, при внутрибольничных инфекциях, при вспышках ОРЗ и др.;
- возможность использования микроколичества сыворотки (1 мкл) для проведения анализа;
- отсутствие необходимости в трудоемких операциях по титрованию антител (при количественной индикации результатов реакции на мультискане).
Для проведения иммуноферментного анализа используют тест-системы, разработанные и выпускаемые НИИ гриппа РАМН.
Состав набора:
1. Антигены гриппа сухие (0,1 мл) вируса А (ВГА
(или вируса гриппа В (ВГВ)
РС-вируса (РСВ)
аденовируса (АВ)
парагриппа 3 типа (ПГ3) 1 амп.
2. Планшеты для иммуноферментного анализа 1 шт.
3. Контрольные сыворотки, содержание антитела
к используемым антигенам, сухие, 0,1 мл (К+) 1 амп.
4. Контрольные сыворотки, не содержащие антител
к используемым антигенам, сухие, 0,1 мл (К-) 1 амп.
5. Антитела диагностические к иммуноглобулинам
человека класса IgG (или IgM), меченные
пероксидазой (конъюгат), 0,01 мл 1 фл.
6. Ортофенилендиамин (ОФД), 10 мг 1 фл.
7. Перекись водорода, 3% раствор, 0,1 мл 1 фл.
8. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ),
смесь солей, 45 мг 1 фл.