9. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ), смесь
солей, 5,25 г 1 фл.
10. Твин-20, 0,250 мл 1 фл.
11. Желатиновая смесь, 4 мл 3 фл.
12. Натрий фосфорнокислый двузамещенный
двуводный 108 мг 1 фл.
13. Лимонная кислота, 63 мг 1 фл.
14. Серная кислота - 1 М раствор, 5 мл 1 фл.
Приготовление растворов
1. ФСБ
Для получения 0,5 л ФСБ содержимое флакона N 9 растворяют в 500 мл дистиллированной воды.
2. Промывающий раствор (ПР)
Для получения ПР к 500 мл ФСБ добавляют 0,25 мл твина-20.
3. Раствор для разведения К-, К+, конъюгата и исследуемых сывороток (РРК)
Для получения РРК во все флаконы с желатиновой смесью добавляют по 4,0 мл подогретой (50-55 °С) дистиллированной воды, содержимое флаконов объединяют, к смеси добавляют 40 мл ПР.
4. КББ
Для получения раствора КББ содержимое флакона N 8 растворяют в 10 мл дистиллированной воды.
5. К+, К- и исследуемые сыворотки
В ампулы с К+ и К- добавляют дистиллированную воду по 0,1 мл и разводят как указано на этикетке. Исследуемые сыворотки разводят 1:400 и 1:800 на РКК.
6. ОФД. Готовят непосредственно перед употреблением.
Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного двуводного (флакон N 12) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор А). Навеску лимонной кислоты (флакон N 13) растворяют в 3 мл дистиллированной воды (раствор В). Смешивают 2,5 мл раствора А и 2,5 мл раствора В, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой (цитратно-фосфатный буфер (ЦФБ) рН 5,0+-0,1). Навеску ОФД (флакон N 6) растворить в 10 мл ЦФБ, добавить 0,1 мл 3%-ного раствора перекиси водорода (флакон N 7), перемешать.
7. Конъюгат. Рабочее разведение.
Содержимое ампулы (0,01 мл) растворяют в РКК до титра, указанного на этикетке.
8. Антигены. Антигены регидратируют дистиллированной водой до первоначального объема (0,1 мл), затем добавляют 10 мл КББ.
Проведение иммуноферментного анализа
1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антигена. Планшет накрывают крышкой, инкубируют 18 ч при (4-6) °С.
2. По окончании срока инкубации раствор антигена удаляют, планшеты промывают 3 раза ПР.
3. В лунки планшета А1, В1 вносят по 100 мкл раствора К+, в лунки С1, D1 - по 100 мкл раствора К-, в лунки Е1, F1, G1, H1 - по 100 мкл ФСБ. В остальные лунки планшета вносят по 100 мкл исследуемых сывороток, разведенных каждая 1:400 и 1:800 на РКК.
4. Планшеты накрывают крышкой и инкубируют 2 ч при 37 °С.
5. По окончании инкубации планшеты освобождают от содержимого, промывают 4 раза ПР.
6. Во все лунки вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата.
7. Инкубируют планшеты в закрытом виде 45 мин при 37 °С.
8. Удаляют содержимое лунок, планшеты промывают 4 раза ПР.
9. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора ОФД.
10. Инкубируют 10-20 мин при температуре 20-25 °С в темном месте.
11. Для остановки реакции в каждую лунку добавляют по 50 мкл серной кислоты (флакон N 14).
Учет и интерпретация результатов
Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 490 нм. Установку "бланк" спектрофотометра осуществляют по лункам С1-Н1 каждого планшета. Оценку результатов исследования производят только в том случае, если средний показатель оптической плотности (ОП490) в К+ выше, чем в К-, не менее, чем на 0,5 ед. ОП490. Увеличение ОП490 на 0,3 ед. и более в сыворотке реконвалесцента по сравнению с сывороткой в том же разведении, полученной в острой фазе заболевания, расценивается как диагностически достоверное.
Адрес изготовителя: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 15/17
НИИ гриппа; тел. 234-12-10, 234-58-75,
234-15-48
факс (812) 234-01-50
| Начальник Управления профилактической медицины Минздравмедпрома России | Р.И. Халитов |
| Начальник Управления Государственного санитарно-эпидемиологического надзора и экспертизы Госкомсанэпиднадзора России | В.И. Чибураев |
Приложение 5
к приказу Минздравмедпрома
и Госкомсанэпиднадзора РФ
от 19 апреля 1995 г. N 101/46
Методические рекомендации по комплексной терапии тяжелых форм гриппа
В эпидемиях гриппа, особенно обусловленных появлением новых разновидностей вирусов, регистрируется значительное число больных тяжелыми и осложненными формами, что требует проведения энергичных лечебных мероприятий в условиях стационара.