Подготавливают три стерильные пробирки вместимостью 10 см
. В первую пробирку наливают 1 см фосфатного буферного раствора 2 и 1 см основного раствора стрептомицина, во вторую - 9 см фосфатного буферного раствора 2 и 1 см раствора из первой пробирки, в третью - 9 см стерильного обезжиренного молока по 5.1.1.5, б и 1 см раствора из второй пробирки.
. В первую пробирку наливают 1 см фосфатного буферного раствора 2 и 1 см основного раствора стрептомицина, во вторую - 9 см фосфатного буферного раствора 2 и 1 см раствора из первой пробирки, в третью - 9 см стерильного обезжиренного молока по 5.1.1.5, б и 1 см раствора из второй пробирки. Массовая концентрация стрептомицина в разведениях составляет соответственно 250; 25 и 2,5 мкг/см соответственно. Третье разведение массовой концентрации 2,5 мкг/см является контрольным раствором.
соответственно. Третье разведение массовой концентрации 2,5 мкг/см является контрольным раствором. Срок хранения контрольного раствора стрептомицина - не более 12 ч.
Допускается вместо контрольного раствора стрептомицина использовать предварительно восстановленный по ГОСТ 23454 (аналогично) препарат СКИВ по 3.29.
5.1.2 Проведение определения
5.1.2.1 На поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри по 5.1.1.4, пробойником по 3.14 или пробочным сверлом вырезают семь лунок диаметром 10 мм (см. рисунок 1). Шесть лунок располагают по окружности чашки на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 28 мм их центров от центра чашки. Седьмую лунку вырезают в центре чашки в случае использования контрольного раствора стрептомицина.
 | |
| 154 × 158 пикс. Открыть в новом окне | |
Рисунок 1 - Схема расположения лунок
5.1.2.2 В шесть лунок, расположенных по окружности чашки, пипеткой по 3.23 вносят по 0,05 см
анализируемого молока, подготовленного по 5.1.1.5, а. В центральную лунку вносят 0,05 см контрольного раствора стрептомицина.
анализируемого молока, подготовленного по 5.1.1.5, а. В центральную лунку вносят 0,05 см контрольного раствора стрептомицина. 5.1.2.3 Чашки Петри выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин, затем их помещают в термостат крышками вверх и инкубируют при температуре (55±1) °С в течение 4 ч. Чашки в термостате размещают в один ряд.
5.1.3 Обработка результатов
5.1.3.1 Результаты определения оценивают непосредственно после инкубирования по 5.1.2.3, просматривая чашки Петри в проходящем свете от любого источника света.
Диаметры зон ингибиции роста тест-культуры, образуемых при взаимодействии с антибиотиками в пробах анализируемого молока и контрольным раствором стрептомицина, измеряют линейкой или на аппарате "Микрофот 5ПО-1" по краям окружностей зон.
5.1.3.2 При отсутствии зон ингибиции контрольного раствора стрептомицина (центральная лунка) определение повторяют.
5.1.3.3 Зона ингибиции диаметром 12 мм и более свидетельствует о присутствии антибиотиков в анализируемой пробе молока.
Зона ингибиции диаметром не более 12 мм или ее отсутствие свидетельствует об отсутствии антибиотиков в анализируемой пробе.
5.2 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бромкрезолпурпур
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis C953 от фиолетовой до желтой - при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и сохранении фиолетовой окраски - при наличии антибиотиков.
5.2.1 Подготовка к определению
5.2.1.1 Подготовка бутылочек со средой N 1
Стеклянную бутылочку со средой N 1 по 3.43 вынимают из холодильника и выдерживают в течение 20 мин при температуре (20±5) °С.
Открывают бутылочку, колпачок помещают на стол вниз донышком.
Пинцетом вынимают капсулу с силикагелем и поролоновый уплотнитель. Насыпают в колпачок необходимое количество таблеток питательной среды. Поролоновый уплотнитель и капсулу с силикагелем помещают в бутылочку.
5.2.1.2 Подготовка ампул со средами N 2 и 3
Осторожно, не повреждая упаковки, отрезают необходимое число ампул от блока со средой N 2 по 3.44 или средой N 3 по 3.45 и маркируют их. Оставшиеся ампулы в упаковке хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С.
Соединительной частью шприца-дозатора по 3.24 прокалывают укупорочный материал ампул со средами N 2 или 3. В каждую открытую ампулу со средой N 2 пинцетом помещают по одной таблетке среды N 1 по 5.2.1.1. Затем бутылочку с таблетированной питательной средой по 5.2.1.1 плотно закрывают колпачком и хранят при температуре (20±2) °С.
5.2.2 Проведение определения
5.2.2.1 В каждую ампулу по 5.2.1.2 шприцем-дозатором вносят по 0,1 см анализируемого молока, используя каждый раз новый наконечник. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С до окончания определения.
анализируемого молока, используя каждый раз новый наконечник. Оставшиеся анализируемые пробы хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С до окончания определения. Ампулы помещают в термостат и выдерживают при температуре (64,0±0,5) °С в течение 3 ч.
5.2.2.2 Контрольное определение проводят в соответствии с 5.2.2.1. В ампулу вносят 0,1 см предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.
предварительно восстановленного по ГОСТ 23454 препарата СКИВ.5.2.3 Обработка результатов
5.2.3.1 Ампулы извлекают из термостата и определяют цвет содержимого анализируемого молока.
5.2.3.2 Желтый цвет содержимого ампул с анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков. Фиолетовое кольцо, образовавшееся на поверхности содержимого ампул (диаметром не более 1 мм), не учитывают.
5.2.3.3 Фиолетовый цвет содержимого ампул с контрольной пробой и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии антибиотиков.
5.3 Метод с Bacillus stearothermophilus и индикатором бриллиантовый черный
Метод основан на изменении окраски агаровой среды со спорами Bacillus stearothermophilus various calidolactis от синей до желтой - при отсутствии в анализируемом молоке антибиотиков и других ингибирующих веществ и сохранении синей окраски - при наличии антибиотиков.
5.3.1 Подготовка к определению
Отрезают необходимое число полосок от тестовых пластин тест-набора N 1 по 3.46 или берут требуемое количество пластин или пробирок тест-набора N 1. Удаляют запаянную фольгу с тестовых полосок и пластин или откупоривают пробирки. Оставшиеся пластины или пробирки хранят в холодильнике при температуре (5±1) °С.
5.3.2 Проведение определения
5.3.2.1 При использовании пластин или полосок в одну из ячеек каждой пластины или полоски одноразовой пипеткой вносят 0,1 см контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46, в другую ячейку - 0,1 см контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0,1 см анализируемого молока в двукратной повторности.
контрольного раствора молока без антибиотиков по 3.46, в другую ячейку - 0,1 см контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные ячейки пластины или полоски вносят по 0,1 см анализируемого молока в двукратной повторности. 5.3.2.2 При использовании пробирок в одну пробирку одноразовой пипеткой вносят 0,1 см контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую - 0,1 см контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0,1 см анализируемого молока в двукратной повторности.
контрольного раствора молока без антибиотиков, в другую - 0,1 см контрольного раствора молока с пенициллином G, в остальные пробирки одноразовой пипеткой вносят по 0,1 см анализируемого молока в двукратной повторности. 5.3.2.3 Тестовые пластины и полоски заклеивают самоклеящейся лентой по 3.46, пробирки закупоривают и помещают в блок термостатированных ячеек по 3.5 или на водяную баню по 3.6 при температуре (65,0±0,5) °С и выдерживают до тех пор, пока содержимое на дне ячейки тестовых пластин или полосок, или пробирки с контрольным раствором молока без антибиотиков не окрасится полностью в желтый цвет в течение (135±15) мин.
5.3.3 Обработка результатов
5.3.3.1 Пробирки, тестовые пластины или тестовые полоски извлекают из блока термостатируемых ячеек или водяной бани и определяют цвет содержимого на дне, не нарушая их целостности.
5.3.3.2 Желтый цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует об отсутствии в нем антибиотиков.
5.3.3.3 Синий цвет содержимого пробирок или ячеек тестовых полосок или пластин с контрольным раствором и анализируемыми пробами молока свидетельствует о наличии в нем антибиотиков.
6 Метрологические характеристики
Наименьшие пределы определения антибиотиков в молоке приведены в таблице 1.
Таблица 1