3.43 Среда N 1 (среда агаровая питательная таблетированная "Delvotest
SP")
- питательная таблетированная среда, упакованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком, капсулой силикагеля и поролоновым уплотнителем.
SP") - питательная таблетированная среда, упакованная в бутылочки из темного стекла с навинчивающимся колпачком, капсулой силикагеля и поролоновым уплотнителем. 
Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована питательная среда "Delvotest SP" (ООО "ДСМ Восточная Европа"). 3.44 Среда N 2 (агаровая среда "Delvotest SP")
- агаровая среда, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см
, собранные в блоки.
SP") - агаровая среда, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см , собранные в блоки. 
Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендована агаровая среда "Delvotest SP" (ООО "ДСМ Восточная Европа"). 3.45 Среда N 3 (среда "Delvotest SP-NT" или "Delvotest SP MINI-NT") - смесь агаровой и питательной сред, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см
, собранные в блоки.
SP-NT" или "Delvotest SP MINI-NT") - смесь агаровой и питательной сред, содержащая споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бромкрезолпурпур, герметично укупоренная в ампулы вместимостью 1,0 см , собранные в блоки. Среда является рекомендуемой к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанной среды. Допускаются к использованию среды производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендованы среды "Delvotest SP-NT" и "Delvotest SP MINI-NT" (ООО "ДСМ Восточная Европа"). 3.46 Тест-набор N 1 (тест-набор "BRT Inhibitor Test") , включающий: герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков.
, включающий: герметично укупоренные пробирки или пластины с агаровой и питательной средой, содержащей споры Bacillus stearothermophilus various calidolactis и индикатор бриллиантовый черный; самоклеящуюся ленту для пластин; контрольный раствор молока с пенициллином G массовой концентрацией 0,004 мкг/г и контрольный раствор молока без антибиотиков. Тест-набор является рекомендуемым к применению. Эта информация приведена для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение указанного тест-набора. Допускаются к использованию тест-наборы производства других изготовителей, предназначенные для целей описываемых методов. Рекомендован тест-набор "BRT Inhibitor Test" (ООО "Хр. Хансен"). Применение конкретных видов оборудования, средств измерений, материалов и реактивов - в соответствии с требованиями разделов 4 и 5.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
4 Отбор и подготовка проб
Отбор и подготовка проб - по ГОСТ 3622, ГОСТ 26668, ГОСТ 26669, ГОСТ 26809 с дополнением. Допускается хранить подготовленные пробы молока в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 24 ч.
5 Методы контроля
5.1 Чашечный метод с Bacillus stearothermophilus
Метод основан на способности антибиотиков, содержащихся в молоке, диффундировать в агаровую среду со спорами Bacillus stearothermophilus и препятствовать их росту, что приводит к образованию прозрачных зон ингибиции. Наличие антибиотиков в молоке устанавливают по размеру диаметра зоны ингибиции.
5.1.1 Подготовка к определению
5.1.1.1 Подготовка лабораторной посуды - по ГОСТ ISO 7218.
5.1.1.2 Приготовление сред
Питательная среда: в мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10,0 г дрожжевого экстракта по 3.32, 20,0 г пептона по ГОСТ 13805, 0,5 г глюкозы по ГОСТ 975, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и потенциометрическим анализатором по 3.7 устанавливают активность питательной среды (7,1±0,1) ед. рН. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см наливают по 200 см приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторе по 3.11 при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.
в небольшом количестве дистиллированной воды по ГОСТ 6709 растворяют 10,0 г дрожжевого экстракта по 3.32, 20,0 г пептона по ГОСТ 13805, 0,5 г глюкозы по ГОСТ 975, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и потенциометрическим анализатором по 3.7 устанавливают активность питательной среды (7,1±0,1) ед. рН. Затем в необходимое количество конических колб по ГОСТ 25336 вместимостью 250 см наливают по 200 см приготовленной питательной среды и стерилизуют в стерилизаторе по 3.11 при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин. Срок хранения питательной среды в холодильнике при температуре (5±1) °С - не более 1 мес.
Агаровая среда: в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 200 см вносят 100 см дистиллированной воды, 1,0 г гидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона, 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1,6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206, перемешивают до полного растворения и нагревают на электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (55±5) °С, устанавливают активность агаровой среды (7,3±0,1) ед. рН и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.
вносят 100 см дистиллированной воды, 1,0 г гидролизата кормовых дрожжей, 0,4 г пептона, 0,1 г хлористого натрия по ГОСТ 4233 и 1,6 г микробиологического агара по ГОСТ 17206, перемешивают до полного растворения и нагревают на электроплитке до кипения. Затем агаровую среду охлаждают до температуры (55±5) °С, устанавливают активность агаровой среды (7,3±0,1) ед. рН и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин. Срок хранения агаровой среды в холодильнике при температуре (5±1) °С - не более 1 мес.
Допускается применять среды промышленного изготовления, аналогичные указанным выше.
5.1.1.3 Получение спор тест-культуры
Питательную среду, подготовленную по 5.1.1.2, засеивают 2-3 см тест-культуры N 1 по 3.42, выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18-20 ч, тщательно перемешивают, помещают в термостат и нагревают при температуре (55±1) °С в течение 3 сут.
тест-культуры N 1 по 3.42, выращенной в пробирках с этой же средой в течение 18-20 ч, тщательно перемешивают, помещают в термостат и нагревают при температуре (55±1) °С в течение 3 сут. После окончания инкубации из посевов берут мазки, окрашивают их спиртовым раствором основного фуксина по 3.31 массовой концентрации 50 г/дм и микроскопируют. При наличии в колбах с посевами 90%-95% свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16-18 ч для осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадок распределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67±2) °С в течение (30±1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3 и центрифугируют в течение 20-30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним.
и микроскопируют. При наличии в колбах с посевами 90%-95% свободных сформировавшихся спор колбы помещают в холодильник на 16-18 ч для осаждения спор. Образовавшуюся надосадочную жидкость из колб сливают, а оставшийся осадок распределяют по стерильным центрифужным пробиркам и прогревают на водяной бане при температуре (67±2) °С в течение (30±1) мин. После этого пробирки помещают на центрифугу по 3.3 и центрифугируют в течение 20-30 мин. Полученный осадок в каждой пробирке промывают дистиллированной водой (не менее трех раз) до получения прозрачной жидкости над ним. Взвесь спор повторно нагревают при температуре (67±2) °С в течение (30±1) мин и переносят в пробирки.
Срок хранения спор тест-культур в холодильнике при температуре (5±1) °С - не более 2 мес.
5.1.1.4 Приготовление засеянной агаровой среды
В пробирки отбирают взвесь спор тест-культуры, подготовленной по 5.1.1.3, и разводят дистиллированной водой до получения суспензии спор, визуально соответствующей 10 единицам по стандартному эталону мутности.
К 100 см расплавленной и охлажденной до температуры (60±2) °С агаровой среды, подготовленной по 5.1.1.2, добавляют 2,5 см 40%-ного водного раствора глюкозы и 4 см суспензии спор, подготовленной, как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11±1) см в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336, установленные на горизонтальной поверхности.
расплавленной и охлажденной до температуры (60±2) °С агаровой среды, подготовленной по 5.1.1.2, добавляют 2,5 см 40%-ного водного раствора глюкозы и 4 см суспензии спор, подготовленной, как указано выше. Смесь агаровой среды и суспензии спор тщательно перемешивают и градуированной пипеткой разливают по (11±1) см в подготовленные для определения чашки Петри по ГОСТ 25336, установленные на горизонтальной поверхности. Чашки Петри с засеянной смесью агаровой среды и суспензии спор допускается хранить в холодильнике при температуре (5±1) °С не более 2 сут. Перед проведением определения чашки Петри прогревают в термостате при температуре (55±1) °С в течение (20±1) мин.
5.1.1.5 Подготовка проб и приготовление обезжиренного стерильного молока
а) Подготовка проб
Определению на наличие антибиотиков подлежат пробы молока, давшие положительный результат по ГОСТ 23454 и отрицательный - по ГОСТ 24065, ГОСТ 24066, ГОСТ 24067. В стерильные пробирки пипеткой по ГОСТ 29227 отбирают по 5-10 см анализируемой пробы молока, нагревают на водяной бане при температуре (87±2) °С в течение (10±1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 °С - 25 °С.
анализируемой пробы молока, нагревают на водяной бане при температуре (87±2) °С в течение (10±1) мин и охлаждают в холодной воде до температуры 18 °С - 25 °С. б) Приготовление обезжиренного стерильного молока
Обезжиренное стерильное молоко получают из молока, предварительно проверенного на отсутствие ингибирующих веществ по ГОСТ 23454, с кислотностью 16-18 °Т с применением сепаратора-сливкоотделителя. Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см
и стерилизуют при 101 кПа (1 атм) в течение (10±1) мин.
и стерилизуют при 101 кПа (1 атм) в течение (10±1) мин. 5.1.1.6 Приготовление контрольного раствора стрептомицина
Контрольный раствор стрептомицина используют для проверки активности роста спор тест-культуры.
а) Приготовление фосфатных буферных растворов 1 и 2
Раствор 1: в мерной колбе вместимостью 1000 см в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (6,1±0,1) ед. рН с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39 или соляной кислоты по 3.40.
в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 2,0 г двузамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 2493 и 8,0 г однозамещенного фосфорнокислого калия по ГОСТ 4198 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (6,1±0,1) ед. рН с помощью растворов гидрата окиси калия по 3.39 или соляной кислоты по 3.40. Раствор 2: в мерной колбе вместимостью 1000 см в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 0,523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (7,9±0,1) ед. рН с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты.
в небольшом количестве дистиллированной воды растворяют 16,73 г двузамещенного фосфорнокислого калия и 0,523 г однозамещенного фосфорнокислого калия и доводят объем дистиллированной водой до метки. Устанавливают рН раствора (7,9±0,1) ед. рН с помощью растворов гидрата окиси калия или соляной кислоты. Растворы стерилизуют при температуре (112±2) °С в течение (30±1) мин.
Срок хранения растворов в холодильнике при температуре (5±1) °С - не более 30 сут.
б) Приготовление основного раствора стрептомицина массовой концентрации 500 мкг/см
(5±1) мг стрептомицина растворяют в конической колбе вместимостью 25 см в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина к объему буферного раствора 1 должно быть 1:100.
в фосфатном буферном растворе 1. Соотношение фактического значения массовой концентрации стрептомицина к объему буферного раствора 1 должно быть 1:100. Пример - При массовой концентрации стандарта стрептомицина 760 мкг/см 5 мг антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см буферного раствора 1, получив основной раствор массовой концентрации 500 мкг/см .
5 мг антибиотика (5 мг) растворяют в 7,6 см буферного раствора 1, получив основной раствор массовой концентрации 500 мкг/см . Срок хранения основного раствора стрептомицина в посуде из темного стекла с притертой пробкой при температуре (5±1) °С - не более 30 сут.
в) Приготовление контрольного раствора стрептомицина массовой концентрации 2,5 мкг/см