9.4 Изготовление срезов
9.4.1 Из фиксированных образцов из разных участков вырезают не менее трех кусочков размером 15х15х4 мм. На замораживающем микротоме готовят срезы толщиной от 10 до 30 мкм.
9.4.2 С микротомного ножа с помощью тонкой кисточки срезы переносят в кристаллизационную чашку или чашку Петри с водопроводной водой. Под неповрежденный срез быстро подводят предметное стекло (размер 24х72, толщина 1,1 мм), обработанное яичным белком с глицерином. Срез извлекают из воды на середину стекла, удерживая его там препаровальной иглой. Срез должен быть неповрежденным.
9.5 Окрашивание срезов
9.5.1 Окрашивание гематоксилин-эозином
На первом этапе срезы окрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха от 3 до 4 мин и промывают 2 мин в воде. Для удаления избытка гематоксилина срезы опускают в 1%-ный раствор соляной кислоты (солянокислая вода) до появления розовой окраски, затем в аммиачную воду до появления синего окрашивания и промывают водой в течение 2 мин. Докрашивают срезы 1%-ным водно-спиртовым раствором эозина в течение 1 мин и ополаскивают водой.
Результаты окраски: в животных тканях ядра клеток темно-синие, цитоплазма принимает красные тона различной интенсивности и оттенка. В растительных тканях выделяются клеточные оболочки, цитоплазма светлая.
На первом этапе срезы окрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха от 3 до 4 мин и промывают 2 мин в воде. Для удаления избытка гематоксилина срезы опускают в 1%-ный раствор соляной кислоты (солянокислая вода) до появления розовой окраски, затем в аммиачную воду до появления синего окрашивания и промывают водой в течение 2 мин. Докрашивают срезы 1%-ным водно-спиртовым раствором эозина в течение 1 мин и ополаскивают водой.
Результаты окраски: в животных тканях ядра клеток темно-синие, цитоплазма принимает красные тона различной интенсивности и оттенка. В растительных тканях выделяются клеточные оболочки, цитоплазма светлая.
9.5.2 Окрашивание красным пигментом Ж (Судан III или IV) для выявления жира
Срезы выдерживают в 70%-ном спирте от 30 до 60 с. Затем помещают в свежий профильтрованный красящий раствор Судана (до 25 мин). Затем ополаскивают в 70%-ном спирте от 3 до 5 с. Окрашенные таким образом срезы докрашивают гематоксилином и эозином в соответствии с 9.5.1. Результат окраски: жир - оранжево-красного цвета.
Срезы выдерживают в 70%-ном спирте от 30 до 60 с. Затем помещают в свежий профильтрованный красящий раствор Судана (до 25 мин). Затем ополаскивают в 70%-ном спирте от 3 до 5 с. Окрашенные таким образом срезы докрашивают гематоксилином и эозином в соответствии с 9.5.1. Результат окраски: жир - оранжево-красного цвета.
9.6 Заключение срезов под покровное стекло
Для заключения окрашенных срезов под покровное стекло применяют глицерин-желатин, при этом обезвоживания срезов не требуется. Используют покровные стекла размерами 18х18 и 24х24 мм при толщине 0,17 мм. После проведения исследования препараты с окраской срезов гематоксилин-эозином и Суданом хранят при комнатной температуре один год.
Для заключения окрашенных срезов под покровное стекло применяют глицерин-желатин, при этом обезвоживания срезов не требуется. Используют покровные стекла размерами 18х18 и 24х24 мм при толщине 0,17 мм. После проведения исследования препараты с окраской срезов гематоксилин-эозином и Суданом хранят при комнатной температуре один год.
10 Проведение измерений и обработка результатов
10.1 Приготовленные гистологические препараты рассматривают под любым световым микроскопом проходящего света. Сначала используют обзорные план-объективы - 10-кратный или меньше, а затем объектив - 20(25)-кратный. Окуляры применяют с 10- или 16-кратным увеличением. Определение дисперсности проводят с использованием такого увеличения объектива, чтобы в поле зрения находилось от 10 до 50 измеряемых частиц. Измерение проводят с помощью окуляр-микрометра или системы анализа изображения.
10.2 При проведении измерений дисперсности частиц компонентов анализируемого продукта следует оценивать их в следующей последовательности: частицы скелетной мускулатуры, жировой ткани, соединительной ткани. Измерение частиц растительных компонентов проводится на тех же срезах, что и для анализа животных компонентов.
10.3 Проведение измерений размеров частиц компонентов (дисперсности)
10.3.1 Определение цены деления окуляр-микрометра
Прежде чем приступить к работе с окуляр-микрометром, необходимо определить цену его деления для каждого используемого в работе сочетания объективов и окуляров.
Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, устанавливаемую в окуляр, в центре которой нанесена линейка длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей по 0,1 мм каждая. Перед измерением проводят определение цены деления шкалы окулярного микрометра. Для этого на предметный столик помещают объект-микрометр, и оценка проводится при каждом используемом сочетании окуляра и объектива. Объект-микрометр проходящего света представляет собой предметное стекло с нанесенной линейкой длиной 1 мм, разделенной на 100 частей и покрытой покровным стеклом. Одно деление шкалы объект-микрометра соответствует 0,01 мм или 10 мкм. Шкалы объект-микрометра и окулярного микрометра устанавливают параллельно, при этом совмещают их нулевые отметки. Затем определяют, сколько делений объект-микрометра точно совпадает с делениями окуляр-микрометра.
Прежде чем приступить к работе с окуляр-микрометром, необходимо определить цену его деления для каждого используемого в работе сочетания объективов и окуляров.
Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, устанавливаемую в окуляр, в центре которой нанесена линейка длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей по 0,1 мм каждая. Перед измерением проводят определение цены деления шкалы окулярного микрометра. Для этого на предметный столик помещают объект-микрометр, и оценка проводится при каждом используемом сочетании окуляра и объектива. Объект-микрометр проходящего света представляет собой предметное стекло с нанесенной линейкой длиной 1 мм, разделенной на 100 частей и покрытой покровным стеклом. Одно деление шкалы объект-микрометра соответствует 0,01 мм или 10 мкм. Шкалы объект-микрометра и окулярного микрометра устанавливают параллельно, при этом совмещают их нулевые отметки. Затем определяют, сколько делений объект-микрометра точно совпадает с делениями окуляр-микрометра.
 | |
| 677 × 274 пикс. Открыть в новом окне | |
10.3.2 Измерение с помощью окулярного микрометра
При проведении измерений с использованием окуляр-микрометра руководствуются 10.3.1. Измерение допускается проводить с использованием любого объектива, но так, чтобы измеряемых структур в поле зрения было от 10 до 50. Дальнейшие расчеты проводят по формуле
При проведении измерений с использованием окуляр-микрометра руководствуются 10.3.1. Измерение допускается проводить с использованием любого объектива, но так, чтобы измеряемых структур в поле зрения было от 10 до 50. Дальнейшие расчеты проводят по формуле
 | |
| 663 × 173 пикс. Открыть в новом окне | |
Упомянутый метод измерения позволяет измерять объекты с точностью до 0,5 мк.
С помощью окуляр-микрометра можно измерить: максимальный диаметр окружности или эллипса, условно описываемых вокруг анализируемой структуры, максимальный диаметр частиц, длину и площадь срезов или определенных участков.
10.3.3 Проведение измерений при помощи системы анализа изображения
При проведении измерений с помощью системы анализа изображения для частиц сложной формы измеряют максимальный диаметр Фере, для линейных частиц - их длину. При невозможности автоматического разделения частиц компонентов используют их интерактивное разделение. Получают следующие результаты: общее количество частиц, минимальные и максимальные размеры частиц, средние размеры частиц и их процентное соотношение, а также другие параметры в соответствии с программой системы анализа изображения. Статистические результаты получают автоматически в виде таблиц, графиков распределения размеров или диаграмм.
При проведении измерений с помощью системы анализа изображения для частиц сложной формы измеряют максимальный диаметр Фере, для линейных частиц - их длину. При невозможности автоматического разделения частиц компонентов используют их интерактивное разделение. Получают следующие результаты: общее количество частиц, минимальные и максимальные размеры частиц, средние размеры частиц и их процентное соотношение, а также другие параметры в соответствии с программой системы анализа изображения. Статистические результаты получают автоматически в виде таблиц, графиков распределения размеров или диаграмм.
10.4 Обработка результатов
На основании полученных данных рассчитывают процент частиц, превышающих нормативный размер.
На основании полученных данных рассчитывают процент частиц, превышающих нормативный размер.
 | |
| 658 × 205 пикс. Открыть в новом окне | |
11 Требования к условиям измерений
Для получения достоверных результатов необходимо исследовать не менее трех срезов с каждого из трех кусочков, отобранных от каждого образца. За окончательный результат принимается среднеарифметическое значение, полученное от трех параллельных измерений не менее ста частиц. При недостаточной точности получаемого результата количество измеряемых частиц необходимо увеличить.
Обязательным параметром является количество и процент частиц, превышающих нормируемый размер. Остальные параметры - информационные.
Обязательным параметром является количество и процент частиц, превышающих нормируемый размер. Остальные параметры - информационные.
Приложение А (обязательное). Пример определения цены деления окуляр-микрометра
А.1 В 32 делениях объект-микрометра полностью укладывается 16 делений окуляр-микрометра; значение одного деления шкалы объект-микрометра известно и равно 0,01 мм или 10 мкм. Цену деления шкалы окуляр-микрометра рассчитывают по формуле
А.2 Зная цену одного деления окуляр-микрометра при заданном увеличении, можно приступить к измерению объектов. При этом соответствующее длине измеряемого объекта число делений окуляр-микрометра необходимо умножить на 20 мкм (найденную цену одного деления).
____________________________________________________________________