4.1.1.2.1 Приготовление питательных сред
Испытание гидролизатов
В гидролизатах определяют массовые доли аминного азота и пептидов по ГОСТ 29311, после чего готовят раствор гидролизата в деминерализованной воде (бульон) массовыми долями аминного азота от 0,15 до 0,18% и пептидов не менее 1,5%. Недостаток пептидов компенсируют добавлением сухого ферментативного пептона. В приготовленный бульон добавляют хлористый натрий из расчета 0,5 г на 100 
бульона.
бульона. Устанавливают рН среды по потенциометрическому анализатору в диапазоне 7,4-7,6, добавляя растворы гидроокиси натрия или соляной кислоты, и кипятят в течение 5-7 мин. Среду охлаждают и проверяют рН. Если требуется, рН корректируют, после каждой коррекции нагревая среду до кипения. После охлаждения среды рН должен быть от 7,4 до 7,6.
Среду фильтруют, разливают в пробирки по 6-8 
. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и пергаментными колпачками. Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 мин. После стерилизации рН среды должен быть от 7,2 до 7,6.
. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и пергаментными колпачками. Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 30 мин. После стерилизации рН среды должен быть от 7,2 до 7,6. Испытание мясной воды
Мясную воду фильтруют. К 100 
фильтрата добавляют 1 г сухого ферментативного пептона по ГОСТ 13805 или другого, используемого в качестве стандартного образца, и 0,5 г хлористого натрия. Устанавливают рН среды (МПБ), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют, как при испытании гидролизатов.
фильтрата добавляют 1 г сухого ферментативного пептона по ГОСТ 13805 или другого, используемого в качестве стандартного образца, и 0,5 г хлористого натрия. Устанавливают рН среды (МПБ), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют, как при испытании гидролизатов. Испытание пептона
Готовят МПБ так же, как при испытании мясной воды. При этом к 100 
мясной воды по ГОСТ 20729 добавляют вместо пептона по ГОСТ 13805 1 г испытуемого пептона.
мясной воды по ГОСТ 20729 добавляют вместо пептона по ГОСТ 13805 1 г испытуемого пептона. Устанавливают рН среды, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют, как при испытании гидролизатов.
4.1.1.2.2 Подготовка чашек Петри с МПА
МПА по ГОСТ 29112 расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до температуры от 55 до 45°С, асептически разливают в стерильные чашки Петри толщиной слоя около половины высоты чашки и оставляют при комнатной температуре до застывания.
4.1.1.2.3 Хранение и реактивация культур тест-штаммов микроорганизмов
Культуры тест-штаммов микроорганизмов хранят в лиофилизированном состоянии в ампулах или пробирках с питательными средами. Пробирки закрывают резиновыми или ватно-марлевыми пробками. Ватно-марлевые пробки парафинируют. Лиофилизированные культуры в ампулах хранят при температуре ниже 5°С, в пробирках - при температуре от 4 до 6°С.
Перед употреблением культуры реактивируют: из ампул и пробирок дважды пересевают в МПБ и культивируют в термостате при (
)°С в течение 20-24 ч. Для последующей работы возможны еще два пересева в жидкие питательные среды.
)°С в течение 20-24 ч. Для последующей работы возможны еще два пересева в жидкие питательные среды. 4.1.1.3 Проведение испытания
В пробирку с испытуемой питательной средой, приготовленной по 4.1.1.2.1, вносят 0,2 
20-24-часовой бактериальной культуры, подготовленной по 4.1.1.2.3.
20-24-часовой бактериальной культуры, подготовленной по 4.1.1.2.3. Пробу инкубируют 20-24 ч при (
)°С, после чего из полученной исходной культуры делают серию десятикратных разведений:
)°С, после чего из полученной исходной культуры делают серию десятикратных разведений: в ряд пробирок (от 5 до 7) наливают по 4,5 
стерильного изотонического раствора хлористого натрия;
стерильного изотонического раствора хлористого натрия; в первую пробирку с раствором хлористого натрия пипеткой вносят 0,5 
культуры и тщательно перемешивают - разведение в 10 раз, показатель разведения - 
;
культуры и тщательно перемешивают - разведение в 10 раз, показатель разведения - ; во вторую пробирку из первого разведения чистой пипеткой переносят 0,5 
суспензии и перемешивают - разведение в 100 раз, показатель разведения - 
;
суспензии и перемешивают - разведение в 100 раз, показатель разведения - ; аналогично делают последующие разведения суспензий.
Из двух разведенных суспензий показателями разведения 
и 
или 
и 
(в зависимости от интенсивности роста микроорганизмов), начиная с последней, отбирают из каждой по 0,1 
в пять чашек Петри с МПА, подготовленных по 4.1.1.2.2, и равномерно распределяют по поверхности среды.
и или и (в зависимости от интенсивности роста микроорганизмов), начиная с последней, отбирают из каждой по 0,1 в пять чашек Петри с МПА, подготовленных по 4.1.1.2.2, и равномерно распределяют по поверхности среды. Дают жидкости впитаться, после чего чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат температурой (
)°С на 20-24 ч. Затем подсчитывают количество выросших колоний во всех чашках.
)°С на 20-24 ч. Затем подсчитывают количество выросших колоний во всех чашках. 4.1.1.4 Обработка результатов
Вычисляют количество КОЕ в 1 
исходной культуры 
, 
, по формуле
исходной культуры , , по формуле
, (1) где 
- суммарное количество колоний в n чашках, КОЕ;
- суммарное количество колоний в n чашках, КОЕ;
- количество колоний в i-й чашке, КОЕ;
- показатель разведения для i-й чашки (от 
до 
); n - количество чашек, в которых производили подсчет количества колоний, шт.;
- объем разведенных суспензий, вносимых в каждую i-ю чашку, 
. 4.1.2 Турбидиметрический метод
Сущность метода заключается в выращивании тест-штаммов микроорганизмов в жидкой или на плотной питательной среде и фотометрическом измерении оптической плотности культуральной суспензии: жидкой культуры или смыва культуры с плотной среды.
4.1.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы Аппаратура, материалы и реактивы по 4.1.1.1.
Фотоэлектроколориметр для определения при длинах волн 520-560 или 630-670 нм, погрешностью измерений коэффициента пропускания 
.
. Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 5 мм.
Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86, эквивалентный 10 международным единицам.
Агар микробиологический по ГОСТ 17206.
Среда Китт-Тароцци.
Масло вазелиновое по ГОСТ 3164.
Культура тест-штамма анаэробных микроорганизмов Clostridium oedematiens 198 (C. oedematiens).
Допускается применять другие средства измерения с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы и среды по качеству не ниже указанных.
4.1.2.2 Подготовка к испытанию
4.1.2.2.1 Приготовление питательных сред
Жидкие питательные среды готовят по 4.1.1.2.1.
Жидкую питательную среду для анаэробной культуры разливают в пробирки по 10 
, на столб жидкости сверху наслаивают 1 
вазелинового масла и стерилизуют по 4.1.1.2.1. Перед использованием среду регенерируют: пробирки со средой выдерживают в кипящей водяной бане от 10 до 20 мин и остужают до температуры не выше 37°С.
, на столб жидкости сверху наслаивают 1 вазелинового масла и стерилизуют по 4.1.1.2.1. Перед использованием среду регенерируют: пробирки со средой выдерживают в кипящей водяной бане от 10 до 20 мин и остужают до температуры не выше 37°С. Плотные питательные среды готовят из жидких сред, для чего к 100 
жидкой среды по 4.1.1.2.1 добавляют порошкообразный или мелко нарезанный агар от 1 до 2,5 г (в зависимости от его качества) и кипятят среду до полного растворения агара. Если требуется, приготовленную среду фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр, далее разливают в пробирки и стерилизуют по 4.1.1.2.1.
жидкой среды по 4.1.1.2.1 добавляют порошкообразный или мелко нарезанный агар от 1 до 2,5 г (в зависимости от его качества) и кипятят среду до полного растворения агара. Если требуется, приготовленную среду фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр, далее разливают в пробирки и стерилизуют по 4.1.1.2.1. Для работы с плотной питательной средой ее разливают в чашки Петри по методу 4.3.1.2.2 или используют непосредственно в пробирках. В последнем случае производят "скашивание" питательной среды. С этой целью пробирки со средой кипятят в водяной бане до полного расплавления агара, после чего пробирки укладывают на наклонную плоскость с углом наклона примерно 10-20° и выдерживают до застывания среды.
4.1.2.2.2 Реактивация микробных культур