3. Отбор проб
Отбор проб осуществляют с помощью стеклянного или пластмассового батометра. Пробы воды объемом 1 л (для каждого вида анализа) без фильтрации немедленно переносят в стеклянные бутыли и закрывают притертыми пробками. Применение полиэтиленовой посуды, резиновых и полиэтиленовых пробок не допускается. Пробы воды хранят не более суток в темноте при комнатной температуре.
Гексановые и изобутилацетатные экстракты хранят в холодильнике в склянках с притертыми пробками при условии полного отсутствия в них воды. Срок хранения до 4 мес.
4. Подготовка к анализу
4.1. Методы приготовления реактивов для проведения анализа
4.1.1. Безводный сульфат натрия для осушения экстрактов прокаливают в сушильном шкафу при температуре 200-250°C в течение 7-8 ч. Прокаленный сульфат натрия хранят в герметически закупоренной склянке. Срок хранения не ограничен.
4.1.2. Навески сульфата натрия готовят взвешиванием 177 г безводного сульфата натрия.
4.1.3. Навески бикарбоната натрия готовят взвешиванием 10 г натрия углекислого кислого.
4.1.4. Хромовую смесь готовят перед употреблением растворением 9,9 г двухромовокислого калия в 100 мл концентрированной серной кислоты.
4.1.5. Раствор детергентов готовят растворением 10 г любого синтетического моющего средства в 1 л кипящей воды. Используют свежеприготовленный раствор.
4.1.6. 10%-ный раствор бикарбоната натрия готовят растворением 50 г бикарбоната натрия в 100-150 мл дистиллированной воды и последующим доведением объема раствора дистиллированной водой до 500 мл в мерной колбе. Срок хранения раствора 1 год.
4.1.7. Растворы гидроксида натрия концентрациями 1,6 и 4 моль/л готовят растворением 64 и 160 г щелочи в 150-200 мл дистиллированной воды и последующим доведением объемов растворов дистиллированной водой до 1 л в мерных колбах. Срок хранения растворов 1 год.
4.1.8. Гексан перед употреблением очищают следующим образом: 700-800 мл гексана помещают в делительную воронку на 1000 мл, добавляют 50 мл концентрированной серной кислоты и встряхивают в течение 5 мин. Жидкостям дают расслоиться, серную кислоту отбрасывают, затем повторяют встряхивание в аналогичных условиях еще раз с новой порцией серной кислоты. Гексан отмывают от остатков кислоты встряхиванием с дистиллированной водой (порциями по 100 мл) до нейтральной реакции промывных вод. Сушат безводным сульфатом натрия.
Очищенный от примесей гексан перегоняют с дефлегматором, отбрасывая первую порцию 75-80 мл, и собирают фракцию с температурой кипения 67-69°C. Хранят гексан в стеклянной посуде с притертой пробкой не более 1 года.
4.1.9. Изобутиловый эфир уксусной кислоты перед использованием очищают следующим образом: 1000 мл реактива помещают в делительную воронку, добавляют 15 мл раствора гидроксида натрия (1,6 моль/л) и встряхивают в течение 3 мин, затем водно-щелочной слой отбрасывают, эфир промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат безводным сульфатом натрия и перегоняют, собирая фракцию с температурой кипения 116-117°C. Хранят в темной стеклянной посуде не более 1 года.
4.2. Подготовка посуды
Стеклянную посуду и стеклянную вату промывают в следующем порядке: горячим раствором детергентов, дистиллированной водой (трижды), хромовой смесью, дистиллированной водой (трижды), ацетоном. После промывания все оборудование и стеклянная вата сушатся при температуре 150-200°C в течение 2-3 ч.
4.3. Экстракция и ацетилирование хлор- и нитрофенолов
Пробу воды объемом 1 л помещают в делительную воронку и, добавляя по каплям раствор гидроксида натрия концентрацией 4 моль/л, доводят pH до 12-13. Приливают 40 мл н-гексана и энергично встряхивают в течение 3 мин. Дают слоям разделиться (10-12 мин). Нижний водный слой сливают в исходную емкость из-под пробы, гексановый экстракт отбрасывают. Пробу воды опять помещают в воронку и доводят pH до 6-7, приливая по каплям концентрированную соляную кислоту. Добавляют в пробу воды 10 г бикарбоната натрия и встряхивают до полного его растворения. Приливают 1 мл уксусного ангидрида, 30 мл гексана и энергично встряхивают воронку в течение 3 мин. Дают слоям разделиться (10-15 мин). Нижний водный слой сливают в исходную емкость из-под пробы, гексановый экстракт образовавшихся ацетилпроизводных фенолов сливают в склянку, пропуская через воронку с 20-25 г безводного сульфата натрия, ацетилирование и экстракцию повторяют еще раз с теми же объемами реагентов. Водный слой сливают в емкость из-под пробы, гексановый же слой пропускают через ту же воронку с сульфатом натрия, присоединяя к первой порции гексана. Затем приливают к пробе 30 мл гексана и 0,5 мл уксусного ангидрида, встряхивают 3 мин, дают слоям разделиться, нижний водный слой отбрасывают, а гексановый присоединяют к предыдущим двум порциям, фильтруя через ту же воронку с сульфатом натрия. Емкость из-под пробы и делительную воронку обмывают гексаном дважды порциями по 3 мл и присоединяют смыв к экстракту, пропуская его через использованную для фильтрования экстракта воронку с сульфатом натрия. Допускается хранение экстракта в течение 4 мес.
4.4. Концентрирование экстрактов хлор- и нитрофенолов
Высушенный экстракт переносят в грушевидную колбу на 150 мл, обмывают склянку, в которой он хранился, порцией гексана 2-3 мл, присоединяют промывные порции гексана к экстракту и отгоняют гексан в вакууме водоструйного насоса в токе азота до объема около 3 мл на водяной бане при температуре не выше 35°C. Применение смазки или других смазочных материалов не допускается. Концентрированный экстракт переносят в пробирку с помощью капилляра, обмывают колбу порцией гексана 1-2 мл, смыв гексана присоединяют к концентрату в пробирку тем же капилляром и помещают пробирку на водяную баню с температурой 30-40°C, отдувая пары растворителя досуха инертным газом из баллона через редуктор. Растворяют сухой остаток 0,2 мл гексана и аликвоту (1-2 мкл) вводят в хроматограф с ДЭЗ.
4.5. Экстракция алкилфенолов
В емкость с пробой воды объемом 1 л добавляют навеску 177 г сульфата натрия и встряхивают до насыщения, затем пробу воды помещают в делительную воронку на 2 л и, добавляя по каплям концентрированную соляную кислоту, доводят pH до 1-2 (контроль по индикаторной бумаге). Приливают 10 мл изобутилацетата и встряхивают 10 мин. Дают слоям разделиться (10-15 мин), водный слой сливают в исходную емкость из-под пробы, а органический - через воронку с 20-25 г безводного сульфата натрия переносят в склянки объемом 25-30 мл с притертой пробкой. Экстракцию повторяют еще раз с тем же объемом изобутилацетата. Экстракт помещают в ту же склянку. В таком виде экстракты можно хранить в холодильнике в течение 4 мес. Для дальнейшей обработки экстракт переносят в делительную воронку на 50 мл и встряхивают 3 мин с 1 мл 10%-ного раствора бикарбоната натрия. После отстаивания нижний водный слой отбрасывают, а в делительную воронку приливают 1 мл раствора гидроксида натрия концентрацией 4 моль/л и реэкстрагируют фенолы (5 мин). Реэкстракт переносят в пробирку с притертой пробкой и подкисляют концентрированной HCl до pH = 1...2, не давая смеси нагреться выше комнатной температуры. Затем в пробирку вносят 0,1 мл изобутилацетата, закрывают пробкой и встряхивают 5 мин. Из верхнего органического слоя микрошприцем отбирают аликвоту объемом 1-5 мкл для ввода в хроматограф.
5. Проведение анализа
5.1. Схема проведения анализа
1-2 мкл экстрактов (получение см. п.п. 4.3-4.5) вводят в испаритель хроматографа, снабженного ДЭЗ и ПИД соответственно, и записывают хроматограмму. После выхода пика ацетилпроизводного пентахлорфенола (при анализе хлор- и нитрофенолов) и пика 3,4-диметилфенола (при анализе алкилфенолов), имеющих наибольшие индексы удерживания, оставляют прибор в холостом режиме работы на 20 мин во избежание оседания на колонке возможных органических высокомолекулярных примесей, содержащихся в морской воде.
5.2. Проведение холостого определения
5.2.1. Холостое определение проводят перед анализом проб воды. Цель определения - проверка чистоты реактивов и материалов, используемых для анализа. Для выполнения холостого определения берут те же объемы реактивов, что и для одной пробы воды и проводят с ними последовательно все операции, описанные в пп. 4.3-4.5.
5.2.2. Если время удерживания пиков на хроматограмме холостого опыта не совпадает ни с одним из анализируемых фенолов, то холостое определение повторяют для каждой партии реактивов.
5.2.3. Если же на хроматограмме холостого опыта имеются пики с временами удерживания, совпадающими с временами удерживания фенолов, то необходимо путем постадийного исследования установить, какой из реактивов загрязнен, и/или попытаться очистить его, или заменить этим же реактивом, но из другой партии. В случае, если загрязненной оказывается дистиллированная вода, необходимо провести ее очистку.
5.2.4. Для проверки чистоты используемой посуды ее ополаскивают порцией ацетона 3 мл и 1 мкл полученного смывного раствора вводят в испаритель хроматографа. Отсутствие на хроматограмме пиков (кроме пика, соответствующего растворителю) служит доказательством чистоты посуды.
5.2.5. Перед анализом каждой пробы проверяют чистоту микрошприца, используемого для ввода экстракта проб. Для этого набирают 1 мкл чистого ацетона и вводят в испаритель хроматографа. При появлении пиков на хроматограмме (кроме пика растворителя) дополнительно промывают шприц ацетоном и вновь проверяют на чистоту.
6. Подготовка средств измерений к работе
6.1. Способы приготовления стандартных растворов хлор- и нитрофенолов
6.1.1. Для приготовления стандартных растворов индивидуальных фенолов взвешивают на аналитических весах по 0,002 г 3-хлор-, 2,4-дихлор-, 2,4,6-трихлор- и пентахлорфенола. Переносят навески в отдельные мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяют в небольшом количестве ацетона и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Каждому полученному раствору приписывают концентрацию 20 мкг/мл.
Для приготовления стандартных растворов 2-нитро- и 4-нитрофенолов взвешивают по 0,03 г фенолов и готовят растворы аналогично вышеописанным. Полученным растворам приписывают концентрации 300 мкг/мл. Растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес.
6.1.2. Непосредственно перед использованием готовят два стандартных ацетоновых раствора в мерных колбах вместимостью 100 мл. Раствор 1: отбирают 2 мл стандартного раствора 4-нитрофенола и по 1 мл стандартных растворов 3-хлор-, 2,4-дихлор- и пентахлорфенолов, доводят объем до метки. Раствор 1 содержит 6 мкг/мл 4-нитрофенола и по 0,2 мкг/мл 3-хлор-, 2,4-дихлор- и пентахлорфенола.
Раствор 2: отбирают 2 мл стандартного раствора 2-нитрофенола и 1 мл стандартного раствора 2,4,6-трихлорфенола. Доводят объем до метки. Раствор 2 содержит 6 мкг/мл 2-нитрофенола и 0,2 мкг/мл 2,4,6-трихлорфенола.
6.2. Способы приготовления стандартных растворов алкилфенолов
6.2.1. В качестве стандартных индивидуальных растворов фенола и 2-метилфенола используют их стандартные образцы с концентрацией 100 и 500 мкг/мл соответственно.
Для приготовления стандартных растворов индивидуальных алкилфенолов взвешивают на аналитических весах по 0,05 г 2,6-диметил-, 2,5-диметил-, 3,5-диметил-, 3,4-диметилфенола. Навески переносят количественно в мерные колбы вместимостью 100 мл, растворяют в небольшом количестве ацетона и доводят объем раствора до метки тем же растворителем. Каждый из полученных растворов имеет концентрацию 500 мкг/мл. Растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес.
6.2.2. Готовят стандартный раствор смеси алкилфенолов в ацетоне с содержанием 1 мкг/мл фенола и по 5 мкг/мл всех остальных алкилфенолов. Для этого в мерную колбу на 100 мл отбирают по 1 мл стандартных растворов собственно фенола и индивидуальных алкилфенолов и доводят объем раствора до метки ацетоном.
6.3. Установление градуировочных характеристик метода определения хлор- и нитрофенолов
6.3.1. Разделение всех определяемых хлор- и нитрофенолов в виде их ацетилпроизводных на насадочной колонке с одной и той же НЖФ не достигается, и необходимо применять две колонки с НЖФ разной полярности. В настоящей методике в качестве таких НЖФ выбраны OV-225 и SE-30. В выбранных условиях проведения анализа (см. п. 7.1.3) не разделяются ацетилпроизводные 2,4,6-трихлорфенола и 2-нитрофенола на колонке с НЖФ OV-225 и 2,4-дихлорфенола и 4-нитрофенола - с НЖФ SE-30.
6.3.2. Установление градуировочных характеристик всех хлор- и нитрофенолов проводят с использованием стандартных растворов 1 и 2 (см. п. 6.1.2). Для этого из раствора 1 в ряд мерных колб вместимостью 1 л отбирают 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл и доводят объемы дистиллированной водой до метки. Концентрации полученных растворов равны соответственно для каждого хлорфенола 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мкг/л, а для 4-нитрофенола - 1,5; 3,0; 4,5; 6,0; 9,0; 12,0; 15,0 мкг/л. Эти растворы проводят через все стадии анализа (см. пп. 4.3, 4.4). Аналитические растворы вводят в хроматограф с ДЭЗ, снабженный колонкой с OV-225.
Из раствора 2 в ряд мерных колб вместимостью 1 л отбирают 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл и доводят объемы дистиллированной водой до метки. Концентрации полученных растворов равны 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 мкг/л для 2,4,6-трихлорфенола и 1,5; 3,0; 4,5; 6,0; 9,0; 12,0; 15,0 мкг/л для 2-нитрофенола. Эти растворы проводят через все стадии анализа (см. пп. 4.3, 4.4). Аналитические растворы вводят в хроматограф с ДЭЗ, снабженный колонкой с SE-30.
6.3.3. Градуировочные графики строят в координатах "площадь пика ацетилпроизводного хлор- или нитрофенола 
- концентрация соответствующего хлор- или нитрофенола (мкг/л)".
- концентрация соответствующего хлор- или нитрофенола (мкг/л)".6.4. Установление градуировочных характеристик метода определения алкилфенолов
6.4.1. Для установления градуировочных характеристик в ряд мерных колб вместимостью 1 л вносят 1,0; 1,5; 2,5; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 мл стандартного раствора смеси алкилфенолов (приготовление см. п. 6.2.2) и доводят объем до метки дистиллированной водой. Полученные растворы имеют концентрации 1,0; 1,5; 2,5; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 мкг/л для собственно фенола и 5,0; 7,5; 12,5; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 мкг/л для всех алкилфенолов. Каждый градуировочный раствор проводят через все стадии анализа (см. п. 4.5). Аналитические растворы вводят в хроматограф с ПИД, снабженный колонкой с АФС.
6.4.2. Градуировочный график строится в координатах "площадь пика фенола 
- концентрация фенола (мкг/л)" для собственно фенола и "площадь пика соответствующего алкилфенола 
- концентрация алкилфенола (мкг/л)" для всех алкилфенолов.
- концентрация фенола (мкг/л)" для собственно фенола и "площадь пика соответствующего алкилфенола - концентрация алкилфенола (мкг/л)" для всех алкилфенолов.