8.4.2 Посевы на чашках Петри по 8.4.1 переворачивают на крышку дном вверх и помещают в термостат при температуре (37
1)°С и инкубируют в течение (24
2) ч.
1)°С и инкубируют в течение (24 2) ч. 8.4.3 После инкубации просматривают чашки с посевами и отмечают присутствие типичных для бактерий рода Shigella колоний и атипичных колоний, которые могут быть отнесены к бактериям рода Shigella. Отмечают их местоположение на дне чашек.
Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на XLD агаре, имеют красный цвет, который принадлежит цвету индикатора.
Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на гектоеновом энтероагаре, имеют зеленый или голубоватый цвет.
Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на дезоксихолатном цитратном агаре, на сальмонелла-шигелла агаре, на средах Эндо, Плоскирева, Левина, круглые бесцветные или слегка розоватые.
Типичные колонии бактерий рода Shigella, вырастающие на висмут-сульфитном агаре, имеют серо-зеленый цвет.
При отсутствии в посевах на селективно-диагностических средах типичных для бактерий рода Shigella колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Shigella в анализируемой пробе продукта.
При наличии хотя бы на одной селективно-диагностической среде типичных колоний проводят подтверждение принадлежности их к бактериям рода Shigella.
8.5 Подтверждение принадлежности выделенных бактерий к роду Shigella
8.5.1 Общие положения
Для определения биохимических характеристик выделенных бактерий допускается использование идентификационных наборов. Эти наборы используют в соответствии с инструкцией.
Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, разрешенных к применению в установленном порядке.
8.5.2 Отбор колоний для подтверждения
Для подтверждения берут с посева в чашку Петри по 8.4.1 (две чашки нормального размера считают за одну) каждой селективной среды (8.4) сначала одну типичную колонию и затем четыре колонии, если первая окажется отрицательной.
Для идентификации в случае эпидемиологической ситуации одновременно отбирают пять колоний. Если на одной чашке меньше пяти типичных колоний, то отбирают все типичные колонии.
Переносят отобранные колонии на скошенную поверхность питательного или ГРМ-агара в чашках или пробирках (5.2.4) или мясо-пептонного агара (5.2.5), для идентификации отбирают полностью изолированные колонии. Посевы инкубируют при температуре (37
1)°С в течение (24
2) ч.
1)°С в течение (24 2) ч. Для биохимической и серологической идентификации используют чистые культуры бактерий.
Из отобранных для биохимической идентификации колоний приготовляют мазки и окрашивают по Граму по ГОСТ 30425.
Бактерии рода Shigella являются грамотрицательными прямыми палочками.
Допускается окраску по Граму заменять тестом Грегорсена. Для этого на предметном стекле в капле 3%-ного водного раствора калия гидроокиси эмульгируют культуру микроорганизмов, взятую из колонии с агаризованной среды. Если через несколько секунд взвесь ослизнет и за петлей потянутся слизистые нити, то это указывает на принадлежность анализируемой культуры к грамотрицательному виду бактерий. У грамположительных бактерий слизистых нитей не образуется.
8.5.3 Биохимическое подтверждение
У отобранных и предварительно пересеянных культур изучают характер роста на TSI агаре, или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого возможность расщепления мочевины, образования ацетоина, утилизации цитрата, наличие L-лизин декарбоксилазы и подвижность.
8.5.3.1 Общие положения
Петлей инокулируют специфические среды с 8.5.3.2 по 8.5.3.7 каждой культурой, полученной из колоний по 8.5.2.
8.5.3.2 TSI агар (5.2.8), среда Олькеницкого или агар Клиглера
Засевают штрихом скошенную поверхность агара и уколом - столбик. Инкубируют при температуре (37
1)°С в течение (24
2) ч.
1)°С в течение (24 2) ч. Интерпретация изменений в среде
а) Столбик
| - желтый | глюкозу ферментирует (реакция положительная) |
| - красный или неизменившийся | глюкозу не ферментирует (реакция отрицательная) |
| - черный | образование сероводорода |
| - пузырьки или разрывы | образование газа при ферментации глюкозы |
б) Скошенная поверхность
| - желтая | лактозу и (или) сахарозу ферментирует (реакция положительная) |
| - красная или неизменившаяся | лактозу и сахарозу не ферментирует (реакция отрицательная) Агар Клиглера содержит два сахара (глюкозу и лактозу), поэтому по скошенной поверхности учитывают ферментацию только лактозы |
Типичные культуры бактерий рода Shigella показывают щелочную (красную) скошенную поверхность и кислый (желтый) столбик без образования газа (пузырьков), сероводород (черный агар) не образуется.
Отношение выделенных культур к бактериям рода Shigella не может основываться только на результатах теста на TSI агаре или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.
Дальнейшему испытанию подвергаются бактерии, показавшие типичные характеристики на TSI агаре или на агаре Клиглера, или среде Олькеницкого.
При снятии результатов роста выявленных бактерий на трехсахарном агаре (агаре Клиглера, среде Олькеницкого) учитывают типичный рост для бактерий рода Salmonella, руководствуясь требованиями ГОСТ 52814. Если подобный рост бактерий обнаружен, то дальнейшее испытание проводят с учетом возможного присутствия бактерий рода Salmonella.
8.5.3.3 Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (5.2.9)
Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (37
1)°С в течение (24
2) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.
1)°С в течение (24 2) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени. При положительной реакции, расщеплении мочевины с выделением аммония, цвет фенолового красного изменяется от розового до сильного светло-вишневого.
Для уреазоположительных бактерий реакция в основном становится видимой после 2 ч инкубирования.
Бактерии рода Shigella мочевину не расщепляют.
8.5.3.4 Определение L-лизин декарбоксилазы (5.2.10)
Инокулируют снизу жидкую среду для определения L-лизин декарбоксилазы (5.2.10). Посевы инкубируют при температуре (37
1)°С в течение (24
2) ч.
1)°С в течение (24 2) ч. Помутнение и пурпуровый цвет после инкубации указывают на положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.
Бактерии рода Shigella не обладают L-лизин декарбоксилазой (реакция отрицательная).
8.5.3.5 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) (5.2.11)
Анализируемую культуру суспензируют петлей в стерильной пробирке, содержащей 3 
VP среды (5.2.11) или мясо-пептонного бульона с глюкозой (5.2.6).
VP среды (5.2.11) или мясо-пептонного бульона с глюкозой (5.2.6). Посевы инкубируют при температуре (37
1)°С в течение (24
2) ч.
1)°С в течение (24 2) ч. После инкубации к посеву прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, содержимое пробирки перемешивают после прибавления каждого реактива.
Образование от розового до светло-красного цвета после 15 мин указывает на положительную реакцию.
Бактерии рода Shigella не образуют ацетоин (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).