Сущность метода заключается в приготовлении питательных сред с разным содержанием испытуемых гидролизатов в солевом растворе, высеве на полученные питательные среды культуры линии клеток, оценке состояния культуры (образование монослоя, наличие или отсутствие деструкции) на третьи и седьмые сутки инкубирования и определении оптимальной концентрации гидролизата в среде.
6.4.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы по 6.1.1 и 6.3.1.
Линии клеток ПП, ПК, ПТ или другие, адаптированные к росту на испытуемой среде.
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 3-го класса точности.
6.4.2 Подготовка к испытанию
6.4.2.1 Подготовка питательных сред из гидролизата
Испытуемый сухой гидролизат растворяют в солевом растворе Хенкса из расчета 0,5 г на 100 
раствора. Получают исходный концентрат массовой долей гидролизата 0,500%. Готовят три разведения концентрата, добавляя к одному объему концентрата один, три и семь объемов раствора Хенкса. Массовые доли гидролизата в разведениях составляют 0,250; 0,125 и 0,062% соответственно. Полученные среды (концентрат и его разведения) переносят в стерильные флаконы вместимостью 500 
и добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатого скота объемом 5% объема среды.
раствора. Получают исходный концентрат массовой долей гидролизата 0,500%. Готовят три разведения концентрата, добавляя к одному объему концентрата один, три и семь объемов раствора Хенкса. Массовые доли гидролизата в разведениях составляют 0,250; 0,125 и 0,062% соответственно. Полученные среды (концентрат и его разведения) переносят в стерильные флаконы вместимостью 500 и добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатого скота объемом 5% объема среды. Среды во флаконах проверяют на стерильность по ГОСТ 28085. Для дальнейших испытаний используют только стерильные пробы.
6.4.2.2 Подготовка суспензии клеток
Культуру клеток реактивируют пересевом на проверенный образец среды, аналогичный испытуемой, в четырех культуральных сосудах. Культуру клеток снимают раствором версена, подогретым до 35-37°С, объем которого составляет 3-5% вместимости сосудов. Сосуды с растворами оставляют при комнатной температуре на 5-20 мин до появления в монослое "окон" (начало отделения клеток от стекла). Затем основную массу растворов осторожно сливают, оставляя по 3-7 
, культуральные сосуды (матрасы) переворачивают вниз монослоем и культуру дополнительно выдерживают до полного отделения клеток от стекла. В матрасы вносят питательные среды (исходный концентрат и три разведения) по 6.4.2.1 объемами 3-5% их вместимости, энергично встряхивают и отбирают пробы для подсчета общего количества клеток в камере Горяева по 6.1.2.2.
, культуральные сосуды (матрасы) переворачивают вниз монослоем и культуру дополнительно выдерживают до полного отделения клеток от стекла. В матрасы вносят питательные среды (исходный концентрат и три разведения) по 6.4.2.1 объемами 3-5% их вместимости, энергично встряхивают и отбирают пробы для подсчета общего количества клеток в камере Горяева по 6.1.2.2. Суспензии разводят соответствующей питательной средой до получения количества клеток в 1 
80-100 
. Объем питательной среды рассчитывают с учетом показателя разведения (отношение количества клеток в исходной и разведенной суспензии).
80-100 . Объем питательной среды рассчитывают с учетом показателя разведения (отношение количества клеток в исходной и разведенной суспензии). 6.4.3 Проведение испытания
Суспензии клеток, приготовленные по 6.4.2, вносят в 20 культуральных сосудов (по 5 на каждое разведение гидролизата), заполняя их на 1/10 вместимости. Сосуды с суспензиями клеток помещают в термостат при (
)°С и просматривают пробы под микроскопом на 3 и 7 сут инкубирования, наблюдая рост монослоя и наличие или отсутствие его деструкции. Одновременно определяют массовую долю гидролизата в среде (оптимальную), при которой монослой образуется через 3 сут и сохраняется в течение 7 сут культивирования.
)°С и просматривают пробы под микроскопом на 3 и 7 сут инкубирования, наблюдая рост монослоя и наличие или отсутствие его деструкции. Одновременно определяют массовую долю гидролизата в среде (оптимальную), при которой монослой образуется через 3 сут и сохраняется в течение 7 сут культивирования. Проводят два последовательных пересева клеток в пять сосудов со средой, имеющей оптимальную массовую долю гидролизата, и наблюдают в них рост монослоя, а также наличие или отсутствие его деструкции на 3 и 7 сут культивирования.
6.4.4 Обработка результатов
6.4.4.1 Определение пригодности гидролизата к практическому применению
Определяют ростовые свойства питательной среды для каждой массовой доли гидролизата в пяти повторностях. За результат испытания для каждой массовой доли гидролизата принимают данные, которые повторяются не менее трех раз. Результаты регистрируют в соответствии с таблицей 6.
Таблица 6 - Пример регистрации ростовых свойств гидролизата
Массовая доля гидролизата в испытуемой среде, % | Оценка роста клеток в испытуемой среде за время наблюдения | |
3 сут | 7 сут | |
0,500 | Монослой, начало деструкции | Частичная или полная деструкция монослоя |
0,250 | Монослой | Монослой или начало деструкции |
0,125 | Частичный или полный монослой | Монослой |
0,062 | Частичный монослой | Частичный или полный монослой |
Гидролизат считают пригодным для практического применения, если в средах массовой доли гидролизата от 0,125 до 0,500% он обеспечивает образование монослоя через 3 сут, а в средах массовой доли от 0,062 до 0,250% монослой сохраняется на 7 сут выращивания.
6.4.4.2 Оценка оптимальной массовой доли гидролизата в питательной среде
Оценивают результаты посевов культуры клеток на среды оптимальной массовой доли гидролизата в двух дополнительных пересевах.
Если в обоих пересевах на 3 сут наблюдают образование монослоя, который сохраняется на 7 сут выращивания, гидролизат рекомендуют использовать в составе питательных сред в оптимальной массовой доле. В противном случае определение оптимальной массовой доли гидролизата повторяют.
Приложение А
(справочное)
(справочное)
Термины и определения
А.1 Методы определения ростовых свойств питательных сред для микроорганизмов
ростовые свойства питательной среды для микроорганизмов: Свойства питательной среды обеспечивать рост микроорганизмов (интенсивность роста микроорганизмов, чувствительность к данному виду микроорганизмов; эффективность роста микробных культур) и типичность морфологии микробных клеток и культураль- но-биохимических свойств микроорганизмов.
А.1.1 Методы определения ростовых свойств питательной среды по интенсивности роста тест-штаммов микроорганизмов
интенсивность роста тест-штаммов микроорганизмов на питательной среде: Характеристика питательной среды, определяемая количеством выросших в ней микробных клеток тех или иных видов микроорганизмов, или оптической плотностью культуры, выросшей в жидкой среде, или смыва культуры с поверхности плотной среды.
А.1.2 Метод определения чувствительности питательной среды к разным видам микроорганизмов
чувствительность среды к микроорганизму: Характеристика питательной среды, определяемая минимальным количеством посевного материала данного вида микроорганизмов, который вызывает их рост, и выраженная через показатель разведения или минимальное количество внесенных клеток.
А.1.3 Метод определения эффективности плотной питательной среды для роста микроорганизмов
эффективность плотной питательной среды: Количество выросших на плотной питательной среде колоний микроорганизмов в сравнении с расчетным, выраженное в процентах.
А.1.4 Методы определения влияния питательной среды на типичность микроорганизмов
типичность микроорганизма: Соответствие совокупности свойств микроорганизма, выросшего на испытуемой среде, установленным свойствам типа, вида и штамма: тип дыхания, морфология, окраска по Граму, формы роста в питательных средах и биохимические свойства.
А.2 Методы определения пригодности питательных сред для токсинообразования микроорганизмов по силе образуемого токсина
пригодность питательной среды для токсинообразования микроорганизмов: Способность среды обеспечивать образование токсина при культивировании микроорганизма, характеризующаяся силой токсина.
А.2.1 Метод определения силы токсина на белых мышах
сила токсина: Показатель разведения токсина, 1 
которого приводит к 100%-ной гибели белых мышей, выраженный в единицах DLM на 1 
фильтрата культуры, содержащего токсин.
которого приводит к 100%-ной гибели белых мышей, выраженный в единицах DLM на 1 фильтрата культуры, содержащего токсин. А.2.2 Метод определения силы токсина по индексу ингибирования микробной тест-культуры
сила токсина (индекс ингибирования): Отношение объемных долей токсина в неразведенном фильтрате культуры токсинообразующего микроорганизма и в разведении фильтрата, вызывающем 50%-ную степень ингибирования роста (E. coli). Выражается количеством единиц ингибирования (
).
). степень ингибирования: Отношение оптической плотности культуры E. coli, выросшей в среде с токсином, к оптической плотности культуры E. coli, выросшей в контрольной среде.
единица ингибирования (
): Объемная доля токсина в среде культивирования, соответствующая 50%-ной степени ингибирования роста E. coli.
): Объемная доля токсина в среде культивирования, соответствующая 50%-ной степени ингибирования роста E. coli. А.3 Методы определения ростовых свойств питательных сред для культур клеток
ростовые свойства питательных сред для культур клеток: Способность питательных сред обеспечивать, стимулировать, поддерживать или тормозить рост культур клеток - первичных и перевиваемых (соответственно, ростобеспечивающие, ростстимулирующие, ростподдерживающие или токсические свойства). Характеризуются временем образования и процентом роста монослоя, индексом пролиферации, появлением дегенеративных изменений клеток и деструкцией монослоя.
культура клеток (первичная и перевиваемая): Клетки, растущие in vitro без образования ткани.
первичная культура клеток: Культура из клеток тканей или органов, взятых непосредственно из организма.
перевиваемая культура клеток (линия клеток или клеточная линия): Культура клеток, поддерживаемая путем многократных пересевов клеток ткани.
А.3.1 Метод определения ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток