Государственный стандарт РФ ГОСТ Р 51758-2001 "Среды питательные для ветеринарных целей. Методы биологических испытаний" (введен в действие постановлением Государственного комитета РФ по стандартизации и метрологии от 13 июня 2001 г. N 230-ст) стр. 8

6.1 Метод определения ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток

Сущность метода состоит в приготовлении концентрированной суспензии первичной культуры клеток фибробластов перепелиных или куриных эмбрионов, посеве приготовленных суспензий на испытуемую и контрольную среды, микроскопическом определении процента роста монослоя, расчете ростовых свойств среды в баллах и классификации среды.

6.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы

Анализатор жидкости потенциометрический по ГОСТ 27987, диапазоном измерения рН от 4 до 8 и погрешностью измерения .

рН-электрод стеклянный типа ЭСЛ-41 Г.

Кондуктометр, позволяющий проводить измерения от 0 до 5 мкСим с погрешностью мкСим.

Термометр ртутный стеклянный по ГОСТ 28498, диапазоном измерения от 0 до 100°С и погрешностью измерения °С.

Часы наручные механические по ГОСТ 10733, 4-й группы, 2-го класса, средним суточным ходом от минус 20 до плюс 55 с/сут.

Пипетки по ГОСТ 29227, вместимостью 0,5; 1; 2; 10 и 25 , 2-го класса точности.

Цилиндры по ГОСТ 1770, вместимостью 25, 100, 500 и 1000 .

Термостат, обеспечивающий температуру нагрева .

Микроскоп световой биологический по ГОСТ 8074, обеспечивающий увеличение .

Центрифуга частотой вращения от 1000 до 3000 .

Камера Горяева рабочим объемом 0,9 .

Ножницы глазные.

Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.

Сосуды культуральные рабочей площадью 40 .

Стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284.

Флаконы вместимостью 500 .

Чашки Петри по ГОСТ 25336.

Калий йодистый по ГОСТ 4232, раствор массовой доли 2% в этиловом спирте.

Масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739.

Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.

Сыворотка крови крупного рогатого скота, предварительно тестированная (референс-сыворотка), нативная без консерванта.

Раствор Хенкса сбалансированный солевой.

Трипсин, раствор массовой доли 0,25%.

Синь трипановая, раствор массовой доли 0,1%.

Кристалл-виолета, раствор массовой доли 0,1%.

Динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (трилон Б, версен) по ГОСТ 10652, раствор массовой доли 0,02%.

Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, раствор массовой доли 7,5%, для культур клеток.

Яйца с эмбрионами куриные или перепелиные.

Среды питательные гидролизные - образцы сухие стандартные ССО-ФГМС и ССО-ГЛА.

6.1.2 Подготовка к испытанию

6.1.2.1 Приготовление тест-культуры тканей

Перепелиные или куриные яйца из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям, инкубируют при от 9 до 10 сут. Яйца с хорошо развитыми подвижными эмбрионами помещают в металлические лотки пугой вверх и двукратно погружают в раствор йодистого калия. В боксе поверхность яиц фламбируют и вскрывают по окружности пути глазными ножницами. Стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают хорионаллантоисную оболочку и извлекают эмбрион в чашку Петри. У эмбриона удаляют голову и внутренние органы. Тушку измельчают ножницами на фрагменты длиной не менее 0,5 мм, помещают во флаконы, добавляют раствор Хенкса температурой от 18 до 25°С и объемом, равным двух-, трехкратному объему измельченной ткани. После отстаивания смеси надосадочную жидкость сливают. В суспензию вносят такой же объем свежей порции раствора Хенкса и после отстаивания надосадочную жидкость также сливают. Промывают ткань три-четыре раза до полного осветления надосадочной жидкости.

Во флаконы с измельченной тканью добавляют раствор трипсина температурой 37°С: три объема на один объем ткани. Флаконы выдерживают при температуре от 18 до 25°С от 30 до 45 мин, постоянно перемешивая их содержимое. Надосадочную жидкость сливают. К осадку добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота объемом 5% от объема осадка. Суспензию центрифугируют 10 мин при частоте вращения 1000 . Надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют два-четыре объема раствора Хенкса, осадок ресуспендируют и получают концентрированную суспензию.

6.1.2.2 Подсчет количества клеток в концентрированной суспензии

Отбирают пробу суспензии и разводят ее в 10 раз: к одному объему концентрированной суспензии (0,3-0,5 ) добавляют девять объемов раствора Хенкса (2,7-4,5 ). К 2-3 полученной суспензии добавляют равный объем раствора трипановой сини и перемешивают. Каплю клеточной суспензии помещают на край покровного стекла так, чтобы она заполнила камеру Горяева.

По всей камере под микроскопом подсчитывают общее количество клеток (окрашенных и неокрашенных) и количество жизнеспособных (неокрашенных). Конгломераты считают за одну клетку. Подсчет проводят трижды и за результат принимают среднее арифметическое результатов определений, полученных для общего количества клеток и количества жизнеспособных клеток в камере.

Количество жизнеспособных клеток в 1 концентрированной суспензии , , вычисляют по формуле

, (4)

где А - среднее арифметическое результатов определений количества жизнеспособных клеток, клетки;

В - показатель разведения суспензии растворами Хенкса и трипановой сини;

0,9 - объем камеры Горяева, ;

1000 - коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.

Общее количество клеток в 1 суспензии , , вычисляют по формуле

, (5)

где С - среднее арифметическое результатов определений общего количества клеток, клетки;

Остальные величины - по формуле 4.

6.1.2.3 Приготовление контрольных питательных сред из стандартных образцов