Стандартные образцы питательных сред ССО-ГЛА или ССО-ФГМС растворяют в 400 
стерильной деминерализованной воды электропроводностью не более 0,5 мкСим во флаконах вместимостью 500 
. Флаконы закрывают резиновыми пробками. Растворы хранят не более 2 мес. при температуре от 6 до 10°С.
стерильной деминерализованной воды электропроводностью не более 0,5 мкСим во флаконах вместимостью 500 . Флаконы закрывают резиновыми пробками. Растворы хранят не более 2 мес. при температуре от 6 до 10°С. Перед использованием растворов ССО в качестве контрольных сред корректируют рН до 7,0-7,4 добавлением раствора кислого углекислого натрия (около 3 
).
). 6.1.3 Проведение испытания
Исходную концентрированную суспензию клеток разбавляют исследуемой или контрольной средой для получения рабочих суспензий, содержащих 0,6 млн жизнеспособных клеток в 1 
суспензий в соответствии с таблицей 4. Для этого во флаконы с исследуемой и контрольной средами предварительно вносят референс-сыворотку объемом 2% объема среды.
суспензий в соответствии с таблицей 4. Для этого во флаконы с исследуемой и контрольной средами предварительно вносят референс-сыворотку объемом 2% объема среды. Затем в два стерильных культуральных сосуда наливают из флаконов указанные в таблице 4 объемы исходной суспензии и доливают до общего объема 20 
: первый сосуд - исследуемой средой, второй - контрольной средой. Получают две рабочие суспензии.
: первый сосуд - исследуемой средой, второй - контрольной средой. Получают две рабочие суспензии. Таблица 4 - Приготовление рабочих суспензий клеток из концентрированной суспензии
Количество жизнеспособных клеток в 1  исходной суспензии,  | Объем исходной суспензии клеток, необходимый для получения 20  рабочей суспензии,  |
9,0 | 1,33 |
10,0 | 1,20 |
11,0 | 1,09 |
12,0 | 1,00 |
Из каждой рабочей суспензии готовят рабочие образцы с количеством клеток в 1 
: 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 и 0,1 
, для чего к одному объему рабочих суспензий добавляют следующие объемы тех же сред: 0,2; 0,5; 1; 2 и 5 соответственно.
: 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 и 0,1 , для чего к одному объему рабочих суспензий добавляют следующие объемы тех же сред: 0,2; 0,5; 1; 2 и 5 соответственно. Из рабочих суспензий клеток и каждого рабочего образца высевают по 1 
в четыре пробирки с испытуемой и четыре пробирки с контрольной питательной средой. Выращивают культуры клеток при температуре (
)°С без смены питательной среды в течение 7 сут. Процент роста монослоя определяют через 7 сут микроскопированием образцов пробирочных культур (увеличение 
).
в четыре пробирки с испытуемой и четыре пробирки с контрольной питательной средой. Выращивают культуры клеток при температуре ( )°С без смены питательной среды в течение 7 сут. Процент роста монослоя определяют через 7 сут микроскопированием образцов пробирочных культур (увеличение ). 6.1.4 Оценка результатов
Ростовые свойства питательных сред в зависимости от процента роста монослоя оценивают по четырехбалльной системе: монослойные образцы культур - в 4 балла; образцы с 25, 50 и 75% роста - соответственно в 1, 2 и 3 балла.
По общей сумме баллов во всех 24 пробирочных культурах питательную среду классифицируют следующим образом: 1-й класс - 65-96 баллов; 2-й класс - 33-64 балла и 3-й класс - 16-32 балла. Испытуемые среды, получившие менее 16 баллов, бракуют как неактивные.
Испытуемые среды оценивают в том случае, если контрольная среда ССО-ГЛА или ССО-ФГМС обеспечивает рост тест-культур при посевном количестве клеток в 1 
от 0,1 до 0,2 
и имеет не менее 65 баллов. В противном случае испытания проводят с другим образцом контрольной среды. Примеры расчета ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток приведены в таблице 5.
от 0,1 до 0,2 и имеет не менее 65 баллов. В противном случае испытания проводят с другим образцом контрольной среды. Примеры расчета ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток приведены в таблице 5. Таблица 5 - Примеры расчета ростовых свойств питательных сред
Номер питательной среды | Посевное количество жизнеспособных клеток в 1  суспензии,  | Оценка роста, баллы | Класс питательной среды | |
в пробирке | общая | |||
1 | 0,6 | 4444 | 80 | 1 |
0,5 | 4444 | |||
0,4 | 4444 | |||
0,3 | 4444 | |||
0,2 | 4444 | |||
0,1 | 0000 | |||
2 | 0,6 | 4444 | 56 | 2 |
0,5 | 4444 | |||
0,4 | 4444 | |||
0,3 | 3212 | |||
0,2 | 0000 | |||
0,1 | 0000 | |||
3 | 0,6 | 4444 | 32 | 3 |
0,5 | 3322 | |||
0,4 | 1111 | |||
0,3 | 1100 | |||
0,2 | 0000 | |||
0,1 | 0000 | |||
Контроль | 0,6 | 4444 | 88 | 1 |
0,5 | 4444 | |||
0,4 | 4444 | |||
0,3 | 4444 | |||
0,2 | 4444 | |||
0,1 | 2222 | |||
6.2 Метод определения токсичности питательных сред для первичных культур клеток
Сущность метода состоит в приготовлении концентрированной суспензии первичной культуры клеток фибропластов перепелиных или куриных эмбрионов, посеве приготовленных суспензий на испытуемую и контрольную среды, микроскопическом наблюдении за посевами с целью определения времени образования монослоя, индекса пролиферации, признаков деструкции монослоя и наличия дегенеративных изменений клеток.
6.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы - по 6.1.1.
6.2.2 Подготовка к испытанию
Подготовка к испытанию - по 6.1.2.
6.2.3 Проведение испытания
В четыре пробирки с испытуемой и четыре пробирки с контрольной средой вносят по 1 
суспензии клеток с посевным количеством клеток 0,6 млн, приготовленной по 6.1.2.1. Затем ежедневно в течение 7 сут проводят микроскопию двух пробирочных культур в каждой среде с целью определения времени образования монослоя; через 7 сут роста монослоя оценивают наличие или отсутствие деструкции монослоя и дегенеративных изменений клеток в сравнении с каталогом [2].
суспензии клеток с посевным количеством клеток 0,6 млн, приготовленной по 6.1.2.1. Затем ежедневно в течение 7 сут проводят микроскопию двух пробирочных культур в каждой среде с целью определения времени образования монослоя; через 7 сут роста монослоя оценивают наличие или отсутствие деструкции монослоя и дегенеративных изменений клеток в сравнении с каталогом [2]. Из двух других пробирок с клеточной культурой в каждой среде через 24 ч после образования монослоя удаляют питательную среду, вносят в пробирки по 1 
раствора версена (для снятия клеток) и инкубируют при 
в течение 15-20 мин.
раствора версена (для снятия клеток) и инкубируют при в течение 15-20 мин. Затем трижды подсчитывают общее количество снятых клеток в 1 
каждой суспензии по 6.1.2.2. За результат испытания каждой суспензии принимают среднее арифметическое результатов шести определений.
каждой суспензии по 6.1.2.2. За результат испытания каждой суспензии принимают среднее арифметическое результатов шести определений. 6.2.4 Обработка результатов
6.2.4.1 Определение индекса пролиферации
Индекс пролиферации 
вычисляют по формуле
вычисляют по формуле
, (6) где А - общее количество выросших клеток в 1 
снятой суспензии, 
;
снятой суспензии, ; В - количество посаженных клеток в 1 
посевной суспензии, 
.
посевной суспензии, . 6.2.4.2 Оценка результатов
Среды считают нетоксичными, если они обеспечивают образование монослойной культуры в те же сроки, что и контрольные - не позже 48 ч, без признаков деструкции монослоя и дегенерации клеток в культуре через 7 сут и с индексом пролиферации не менее 0,5. При появлении дегенеративных изменений клеток в культуре и снижении количества выросших клеток более чем на 30% по сравнению с контрольной средой питательную среду выбраковывают как токсичную.
6.3 Метод определения ростовых свойств питательных сред для клеточных линий
Сущность метода заключается в посеве тест-культур клеточных линий на испытуемую и контрольную среды, пересевах после образования монослоя на свежие порции питательных сред и определении времени формирования монослоя, индекса пролиферации, наличия или отсутствия дегенерации тест-культуры и деструкции монослоя.
6.3.1 Аппаратура, материалы и реактивы
Аппаратура, материалы и реактивы по 6.1.1.
Среда питательная 199, среда Игла, среда Игла MEM или другие, предварительно тестированные в качестве контрольных.
Линии клеточные гетероплоидные: ВНК-21; VERO; СПЭВ, ЛЭК, ТЭБ или другие, адаптированные к испытуемой среде.
Линии клеточные диплоидные: 4647; М-22, ЛЭЧ-240 или другие, адаптированные к испытуемой среде.
6.3.2 Проведение испытания
В два культуральных сосуда вносят испытуемую и контрольную среды объемом 1/10 их вместимости, добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатого скота от 2 до 10% объема среды и определенное количество клеток (посевную дозу) тест-линий (10-100 
в зависимости от линии клеток), определенное по 6.1.2. Клетки культивируют при 
. Ежесуточно проводят наблюдения за развитием монослоя микроскопией посевов и определяют время образования монослоя и состояние клеток (наличие или отсутствие дегенеративных изменений клеток) в сравнении с [2].
в зависимости от линии клеток), определенное по 6.1.2. Клетки культивируют при . Ежесуточно проводят наблюдения за развитием монослоя микроскопией посевов и определяют время образования монослоя и состояние клеток (наличие или отсутствие дегенеративных изменений клеток) в сравнении с [2]. Через 1-2 сут после формирования монослоя клетки снимают раствором версена или трипсина и пересевают в новые культуральные сосуды со свежими порциями испытуемой и контрольной сред (второй пассаж). Снова проводят ежесуточные наблюдения под микроскопом за состоянием монослоя и через 1-2 сут после формирования нового монослоя клетки снимают и пересевают. Так повторяют еще два раза (всего пять пассажей).
Из каждого пассажа отбирают пробу снятых клеток и ресуспендируют в объеме среды, равном 1/10 объема сосуда. Смешивают 1 
полученной суспензии c 1 
красителя (раствора трипановой сини или кристалл-виолета), смесью заполняют камеру Горяева и подсчитывают в ней количество клеток.
полученной суспензии c 1 красителя (раствора трипановой сини или кристалл-виолета), смесью заполняют камеру Горяева и подсчитывают в ней количество клеток. 6.3.3 Обработка результатов
6.3.3.1 Для каждого пассажа вычисляют количество снятых клеток в 1 
суспензии, умножая подсчитанное количество клеток на коэффициент 1111.
суспензии, умножая подсчитанное количество клеток на коэффициент 1111. 6.3.3.2 Для каждого пассажа вычисляют индекс пролиферации по 6.2.4.1.
6.3.3.3 Оценка результатов
По ростовым свойствам среду оценивают как нетоксичную, если в каждом пассаже она обеспечивает формирование монослоя клеток через 3-4 сут после посева, имеет индекс пролиферации не ниже 2,0-4,0 (в зависимости от линии клеток) при условии, что клетки на протяжении всего срока культивирования сохраняют типичные, без дегенеративных изменений, черты линии в соответствии с каталогом [2]. В противном случае и при отсутствии тех же признаков токсичности контрольной среды испытуемая выбраковывается. Если контрольная среда проявляет признаки токсичности, оценивание испытуемой среды повторяют с новой контрольной пробой.