Государственный стандарт РФ ГОСТ Р 51758-2001 "Среды питательные для ветеринарных целей. Методы биологических испытаний" (введен в действие постановлением Государственного комитета РФ по стандартизации и метрологии от 13 июня 2001 г. N 230-ст) стр. 7

4.4.3.4 Оценка результатов

Тест-штаммы должны соответствовать характеристикам таблицы 3, что свидетельствует об отсутствии влияния испытуемой питательной среды на типичность микроорганизмов. В противном случае среду бракуют.

При несоответствии сахаролитических свойств тест-штаммов в культурах, полученных в контрольных средах, опыт дважды повторяют с новыми пробами контрольных питательных сред. При несовпадении типичных свойств тест-штаммов данным таблицы 3 в повторных опытах меняют исходную культуру тест-штамма как несоответствующую виду и штамму.

5 Методы определения пригодности питательных сред для токсинообразования микроорганизмов по силе образуемого токсина

5.1 Метод определения силы токсина на белых мышах

Сущность метода заключается в культивировании в испытуемой среде тест-штамма токсинообразующего микроорганизма, стерилизующей фильтрации культуры, приготовлении разведений фильтрата, содержащего токсин, определении максимального разведения фильтрата, вызывающего 100%-ную гибель белых мышей, и расчете силы токсина.

5.1.1 Аппаратура и материалы

Аппаратура и материалы по 4.1.1.1.

Установка для стерилизующей фильтрации с асбестовым стерилизующим или мембранным фильтром диаметром пор 0,22 мкм.

Тест-штамм микроорганизмов: Clostridium perfringens (С. perfringens) типа С, ВТ - или культура другого вида токсинообразующих микроорганизмов, показательная для испытуемой среды.

Белые мыши массой от 16 до 18 г.

Шприц стерильный вместимостью 1 или 2 .

Среда Китт-Тароцци.

5.1.2 Подготовка к испытанию

Питательную среду готовят по 4.1.2.2.1 (для анаэробной культуры).

Тест-штамм С. perfringens реактивируют по 4.1.2.2.2 (для анаэробного тест-штамма).

5.1.3 Проведение испытания

В две-три пробирки с испытуемой средой, приготовленной по 5.1.2, вносят под слой вазелинового масла по 1 20-24-часовой культуры С. perfringens по 5.1.2. Инкубируют от 5 до 6 ч при температуре , после чего выросшую культуру (без вазелинового масла) фильтруют через стерилизующие или мембранные фильтры. Фильтраты объединяют.

Готовят ряд разведений фильтрата изотоническим раствором хлористого натрия: с шагом 10 - от двух до четырех разведений (показатели разведения: 10, , и ); с шагом 2 - для более детального анализа - от шести до десяти разведений (показатели разведения: 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 612 и 1224).

По 0,5 из каждого разведения вводят двум-шести белым мышам в вену хвоста или внутрибрюшинно. Проводят наблюдения за мышами от 1 ч до 4 сут и определяют максимальное разведение, которое вызывает 100%-ную гибель мышей.

5.1.4 Обработка результатов

Вычисляют силу токсина, , умножая показатель максимального разведения на коэффициент 2.

5.2 Метод определения силы токсина по индексу ингибирования микробной тест-культуры

Сущность метода заключается в культивировании в испытуемой среде тест-штамма токсинообразующего микроорганизма, стерилизующей фильтрации культуры, приготовлении разведений фильтрата токсина питательной средой (МПБ), инкубировании чувствительного тест-штамма микроорганизма (E. coli) в фильтрате токсина, его разведениях средой (МПБ) и в контрольных средах, определении оптических плотностей культур E. coli и вычислении степени ингибирования роста E. coli и силы токсина.

5.2.1 Аппаратура и материалы

Аппаратура и материалы по 5.1.1.

Фотоэлектроколориметр для измерения при длинах волн 630-670 нм, погрешностью измерений коэффициента пропускания .

Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 5 мм.

5.2.2 Подготовка к испытанию

Тест-штамм C. perfringens реактивируют по 4.1.2.2.2.

Тест-штамм E. coli реактивируют в МПБ по 4.1.1.2.3.

5.2.3 Проведение испытания

5.2.3.1 В две-три пробирки с 10 испытуемой среды вносят под слой вазелинового масла по 1 20-24-часовой культуры C. perfringens по 5.2.2. Инкубируют от 5 до 6 ч при температуре , после чего выросшую культуру (без вазелинового масла) фильтруют через стерилизующие или мембранные фильтры. Фильтраты объединяют.

Вносят фильтрат (токсин) в МПБ по ГОСТ 20730 в разных соотношениях объемов фильтрата и МПБ, например, 3:1; 1:1; 1:3.

5.2.3.2 В восемь стерильных пробирок вносят по 5-8 проб неразведенного токсина и трех его разведений в МПБ, по две пробирки на каждую пробу, в которых объемные доли токсина составляют 100, 75, 50 и 25% соответственно.

В другие двенадцать пробирок вносят по 5-8 испытуемой среды (контроль для неразведенного токсина) и трех ее разведений мясопептонным бульоном (контрольные среды для разведенного токсина) - по три пробирки на каждую среду.

В восемь пробирок с токсином и восемь пробирок с контрольными средами высевают по 0,2 20-24-часовой культуры E. coli и инкубируют при 37°С от 15 до 17 ч. Затем определяют оптические плотности всех инкубированных культур при длине волны от 630 до 670 нм относительно незасеянной контрольной среды (для каждой среды свой оптический контроль).

5.2.3.3 Рассчитывают средние арифметические результатов двух параллельных определений оптических плотностей для каждой пробы.

5.2.4 Обработка результатов

5.2.4.1 Вычисляют степени ингибирования роста E. coli неразведенным токсином и его разведениями , %, по формуле

, (2)

где - среднее арифметическое оптических плотностей культуры E. coli в фильтрате токсина или в его разведениях;

- среднее арифметическое оптических плотностей культуры E. coli в соответствующей контрольной среде;

100 - коэффициент пересчета в проценты.

5.2.4.2 Строят график зависимости степени ингибирования от объемной доли токсина в среде культивирования, который имеет линейный характер. По оси абсцисс откладывают объемные доли токсина в среде E. coli в процентах: 100% (исходный фильтрат), 75; 50 и 25% (разведения фильтрата). По оси ординат откладывают соответствующие этим процентам степени ингибирования , %. По графику определяют объемную долю токсина, соответствующую 50%-ной степени ингибирования роста E.coli, и принимают ее за единицу ингибирования .

5.2.4.3 Индекс ингибирования для исходного неразведенного фильтрата , , вычисляют по формуле

, (3)

где С - объемная доля токсина, соответствующая 50%-ной степени ингибирования роста E. coli, %;

100 - объемная доля токсина в неразведенном фильтрате, %.

6 Методы определения ростовых свойств питательных сред для культур клеток