После окончания концентрирования (примерно через 16-18 ч, при исследовании 10 л) осуществляют элюцию вирусов со смолы 0,5 М раствором фосфатного буфера с рН 8,2. Для этого в колонку вносят 10 мл фосфатного буфера, интенсивно встряхивают и оставляют в горизонтальном положении в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем элюат переносят в стерильный флакон и доводят до рН 7,2 1М раствором соляной кислоты.
Приготовление 0,5 М фосфатного буфера с рН 8,2
Готовят навески солей: Na2HPO4 2H2O - 89,0 г (раствор А) и KH2РO4 - 68,06 г (раствор В). Каждую навеску вносят в отдельную мерную колбу, добавляют дистиллированную воду до объема 1 л и растворяют соли. Для получения буфера с рН 8,2 смешивают 96,9 мл раствора А и 3,1 мл раствора В и одним из этих растворов доводят рН буфера до 8,2.
5.2.5. Обработка проб (см. п. 5.1.6).
5.2.6. Хранение проб (см. п. 5.1.7).
5.3. Двухэтапный метод концентрирования вирусов (сорбция на ионообменной смоле и осаждение с помощью сульфата аммония)
5.3.1. Область применения
Метод рекомендуется для концентрирования вируса гепатита А и энтеровирусов из проб питьевой воды и воды водоисточников. Объем проб может колебаться от 10 до 50 л.
5.3.2. I этап. Концентрирование и элюция вируса гепатита А и энтеровирусов из проб воды при помощи сорбции на ионообменной смоле
В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной смолы АВ-17-8 (подготовленной в соответствии с п. 5.2.2) и гидроксида алюминия, которой заполняют стеклянную бюретку (колонку) диаметром 36-38 мм и длиной 250-300 мм. Колонка должна иметь в нижней части впаянную перегородку из пористого стекла (стеклянный фильтр Шотта N 2) и резиновый шланг, присоединенный к нижнему концу колонки. После установки колонки в штативе в нее вносят ионообменную смолу (высота столбика смолы должна составлять не менее 30-40 мм) и навеску гидроксида алюминия (8-10 г).
Исследуемую пробу воды в бутылях или канистре подкисляют с помощью соляной кислоты до рН 3,0-4,5, располагают выше колонки и через резиновую трубку с пробкой для колонки подают воду в колонку, регулируя скорость прохождения с помощью винта на резиновой трубке, присоединенной к нижнему концу колонки. Скорость прохождения воды через колонку должна составлять 10-15 мл/мин.
После прохождения исследуемой воды через колонку нижний резиновый шланг перекрывают и осуществляют элюцию вируса с адсорбента при помощи 0,05 М глицинового буфера с рН 11,5, который вносят в колонку в объеме 100 мл. Адсорбент в колонке и элюент тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10-15 мин. Затем элюат удаляют из колонки через нижний резиновый шланг и с помощью глицинового буфера с рН 1,5 устанавливают рН элюата на уровне 7,0-8,0.
Приготовление глицинового буфера с рН 11,5
Навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды и получают глицин. К 50 мл глицина добавляют 50 мл 0,1 N раствора гидроксида натрия и получают глициновый буфер с рН 11,5.
Для приготовления глицинового буфера (рН 1,5-1,6) к 38 мл глицина добавляют 62 мл 0,1N раствора соляной кислоты.
5.3.3. II этап. Вторичное концентрирование антигена и энтеровирусов - осаждение с помощью сульфата аммония
Вторичное концентрирование (осаждение) вирусов проводят на холоде. Для этого к элюату дробно (в течение 20-30 мин) добавляют 1/2 объема насыщенного раствора сульфата аммония / (NH4)2SO4 /, тщательно перемешивают и оставляют на ночь. Утром смесь центрифугируют в течение 1 ч при 5-6 тыс. об./мин. Супернатант сливают, а осадок растворяют в 1-2 мл физиологического раствора с рН 7,2-7,4.
При необходимости концентрат делят на 2 части, одну из которых исследуют на наличие антигена ВГА, другую - подвергают антибактериальной обработке в соответствии с п. 5.1.6 и используют для заражения тканевых культур с целью выделения энтеровирусов.
Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония
В 1 л теплой стерильной дистиллированной воды (30 - 35°С) растворяют 800 г сульфата аммония / (NHS04 /. Полученный раствор фильтруют, доводят до рН 7,2 и охлаждают в холодильнике.
5.3.4. Хранение проб (см. п. 5.1.7).
5.4. Метод концентрирования вирусов с использованием двухфазного разделения
Метод рекомендован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) "Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде", ВОЗ, 2003.
5.4.1. Область применения
Метод концентрирования двухфазным разделением используют для индикации вирусов из 1 л очищенных и неочищенных сточных вод.
5.4.2. Подготовка реактивов (для 2-х проб по 1 л)
5.4.2.1. 22% декстран (по весу) - 40 г декстрана Т 40, 142 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4°С.
5.4.2.2. 29% ПЭГ 6 000 (по весу) - 363 г ПЭГ 6 000 и 888 мл стерильной дистиллированной воды. Для растворения используют магнитную мешалку. Готовый раствор можно хранить 2 недели при 4°С. Раствор можно автоклавировать (15 мин при 45°С).
5.4.2.3. 150 мл (примерно) 5М NaCl.
5.4.2.4. 1 NNaOH и IN HCL для установки рН.
5.4.3. Концентрирование пробы по 0,5 л
5.4.3.1. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 1 000 g. Надосадочную жидкость переносят из пробирок в колбу Эрленмейра емкостью 1 л, осадок хранят при 4°С.
5.4.3.2. Доводят рН надосадочной жидкости до нейтрального уровня (7,0-7,5) 1N раствором NaOH и измеряют конечный объем надосадочной жидкости.
5.4.3.3. К 500 мл надосадочной жидкости добавляют 39,5 мл 22% раствора декстрана, 287 мл 29% раствора ПЭГ 6 000 и 35 мл 5N раствора NaCl. Тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч при температуре 4°С при непрерывном встряхивании или перемешивании, используя прибор горизонтального встряхивания или магнитную мешалку.
5.4.3.4. Для каждой пробы подготавливают стерильную коническую делительную воронку и закрепляют ее в штативе. Смазывают скользящие поверхности кранов, но так, чтобы не закрыть в них отверстие. Проверяют плотность кранов небольшим количеством воды. Смесь, приготовленную по п. 5.4.3.3, переливают в воронку и оставляют на ночь при 4°С.
5.4.3.5. Утром осторожно открывают кран воронки, медленно выпускают жидкость и собирают нижний ее слой и промежуточную фазу в стерильную пробирку (обычно 5-10 мл от каждой пробы объемом 0,5 л.).
5.4.3.6. В полученную жидкость (п. 5.4.3.5) вносят осадок (п. 5.4.3.1), добавляют хлороформ (20% от объема образовавшейся взвеси) и встряхивают в течение 1 мин. Центрифугируют, отбирают верхнюю водную фазу в стерильную пробирку и добавляют антибиотики (пенициллин G или отечественный аналог и стрептомицин до конечной концентрации 100 МЕ/мл и 100 мг/мл соответственно).
5.4.3.7. Помещают 1 мл полученного концентрата в холодильник с температурой -20 или -70°С для сохранения (при необходимости дальнейшего исследования). Остаток концентрата исследуют на наличие вирусов на культурах тканей, РНК методом ОТ-ПЦР и антигена - методом ИФА.
5.5. Метод концентрирования вирусов с помощью флизелиновых пакетов с макропористым стеклом
5.5.1. Область применения
Метод (качественный) используют для концентрирования вирусов из воды поверхностных водоемов, сточной воды. Время концентрирования вирусов должно составлять 3-7 суток.
5.5.2. Подготовка макропористого стекла (МПС)*
Для повышения сорбционных свойств макропористого стекла, представляющего собой белый порошок, его обрабатывают следующим образом: один объем стекла заливают в колбе одним объемом смеси (1 : 1) 3% раствора Н2O2 и 6 М раствора HC1 кислоты и кипятят в вытяжном шкафу в течение 1 ч без пробки, соблюдая меры предосторожности. Отмывают большим количеством дистиллированной воды до нейтрального значения рН и высушивают при 100°С.
В пакет из флизелина размером 5 х 7 см помещают 3,0 см подготовленного сорбента.
5.5.3. Концентрирование вирусов
Пакет с сорбентом закрепляют с помощью лески за неподвижный предмет так, чтобы он оказался в токе воды. После экспозиции в течение 3-7 суток пакет вынимают, помещают в отдельный новый полиэтиленовый мешочек или стерильный флакон и доставляют в лабораторию в сумке-холодильнике в максимально короткий срок (не более 6 ч). Каждую пробу маркируют с указанием точки отбора, датой установки и времени экспозиции пакета. До обработки пробы можно хранить не более суток при 4°С.
5.5.4. Элюция вирусов с МПС
Пакет с сорбентом извлекают из транспортировочной емкости и помещают в стерильную чашку Петри. Обрезают край пакета, вымывают стекло дистиллированной водой (5 мл) с помощью пипетки в эту же чашку Петри и переносят пипеткой или через воронку в колонку объемом 5-10 мл. Вирусы элюируют ступенчато тремя растворами по 3 мл каждый, собирая фракции в отдельные пенициллиновые флаконы. Исследованию подвергают каждую фракцию в отдельности (всего 3 фракции). В качестве элюирующих растворов используют: 1) 0,05 М трис-НСl рН 9,1; 2) 0,05 М трис-HCl рН 9,1 и 0,5 М NaCl; 3) 3% мясной экстракт на 0,05 М трис-HCl рН 9,1.