5.6. Метод концентрирования вирусов с использованием набора для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды с помощью ловушечного устройства
Ловушечное устройство состоит из насадки на водопроводный кран, к которой с помощью синтетической трубки прикреплен держатель. В держатель, состоящий из двух свинчивающихся частей с резьбой, вставляется специальная ловушка, внутри которой находится адсорбент, сорбирующий вирусы из воды. Применяемая ловушка является одноразовой, а само устройство может использоваться после стерилизации многократно в соответствии с прилагаемой инструкцией.
5.6.1. Область применения
Метод используют для концентрирования вирусов из водопроводной воды.
5.6.2. Подготовка ловушечного устройства и фильтрование воды
Перед использованием в ловушечное устройство вставляют ловушку, после чего его заворачивают в бумагу для стерилизации и стерилизуют сухим жаром при температуре 80°С 45 мин. Ловушечное устройство с вставленной ловушкой доставляют на место отбора в стерильной упаковке. После трехкратного обжигания водопроводного крана и спуска воды в течение 15 мин устанавливают необходимую скорость ее протекания - 1 л за ~ 1,5 мин, что составляет 40-45 л/ч. Ловушечное устройство извлекают из стерильной упаковки и устанавливают его на кран. Объем пропускаемой воды должен составить 1000 л, что достигается при скорости тока воды 40-45 л/ч в течение 24 ч. Спустя 24 ч ловушечное устройство снимают с крана и помещают в стерильный пакет, который доставляют в вирусологическую лабораторию. После извлечения ловушки использованное ловушечное устройство подвергают обеззараживанию в 3% растворе перекиси водорода в течение 12 ч, затем многократно (не менее 10 раз) промывают в проточной воде и высушивают для последующей стерилизации и повторного использования.
5.6.3. Элюция сконцентрированных вирусных частиц
Ловушку с адсорбентом в стерильных условиях извлекают из ловушечного устройства и помещают в чашку Петри. С помощью ножниц ловушку вскрывают, содержащийся внутри адсорбент вымывают в чашку Петри стерильной дистиллированной водой в объеме 5-10 мл. Полученную взвесь адсорбента в дистиллированной воде переносят с помощью пипетки с отпиленным концом в стеклянную колонку. Вытекающую из колонки воду собирают в стерильный пенициллиновый флакон. Элюцию вирусов осуществляют с помощью специального элюента, содержащегося в наборе. Для получения рабочего раствора концентрат разводят стерильной дистиллированной водой в соотношении 1:10 (объем элюента/объем воды). Вирус элюируют путем пропускания 3 мл элюента через адсорбент в колонке. Полученную фракцию (элюат) собирают в стерильный пенициллиновый флакон.
Использованный адсорбент заливают 3% раствором перекиси водорода для обеззараживания на 12 ч.
С целью увеличения эффективности обнаружения вирусов в элюатах проб воды при исследовании методом ПЦР (обнаружение РНК энтеровирусов) и ИФА (обнаружение антигенов энтеровирусов) проводят дополнительное концентрирование элюатов с помощью ультрацентрифугирования либо обрабатывают элюаты полиэтиленгликолем 6 000 (ПЭГ 6000).
5.6.3.1. Ультрацентрифугирование элюата.
Ультрацентрифугирование проводят при 40 000-50 000 g в течение 2 ч с использованием угловых или бакет-роторов. В стерильную центрифужную пробирку наливают вируссодержащий элюат, а затем с помощью шприца на дно пробирки наслаивают 10-20% раствор сахарозы так, чтобы она занимала 5-10% от объема пробирки. После центрифугирования супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатно-солевом твинсодержащем буфере (рН 7,2) для ИФА.
5.6.3.2. Обработка элюата полиэтиленгликолем 6 000 (ПЭГ 6 000).
В элюат добавляют ПЭГ 6 000 и хлористый натрий, находящийся непосредственно в пробирках для центрифугирования, до конечных концентраций 10% и 0,5М, соответственно. Смесь тщательно перемешивают до растворения ПЭГ и затем выдерживают в течение 10-12 ч при 4°С. Образовавшуюся суспензию центрифугируют при 10 000 g в течение 1 ч или при 6 000 g в течение 2 ч. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды для ПЦР-исследований или в фосфатносолевом твинсодержащем буфере (рН 7) - для ИФА.
5.6.4. Обработка проб (п. 5.1.6).
5.6.5. Хранение проб (п. 5.1.7).
6. Методы выделения энтеровирусов в культурах клеток
Исследование полученных элюатов на энтеровирусы проводят в культуре ткани в соответствии с документом "Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита", рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения (1998). При этом следует отметить, что для выделения вирусов используют максимально возможный полученный элюат (кроме 1 мл, заложенного на хранение, и объема, используемого для исследования в ИФА и ПЦР). Для выделения вирусов используют следующие культуры тканей: RD, Hep-2, BGM и другие чувствительные к энтеровирусам линии клеток.
Перевиваемые культуры клеток RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM наиболее пригодны для проведения лабораторных исследований и позволяют выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов, которые могут присутствовать в водных объектах окружающей среды.
Культура клеток RD, происходящая из человеческой рабдомиосаркомы, обладает высокой чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим типам вируса ECHO, некоторым вирусам Коксаки А. Вирусы полиомиелита и вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-2, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM - перевиваемая культура клеток почек африканской зеленой мартышки, чувствительна к вирусам полиомиелита и вирусам Коксаки В. Использование, по крайней мере, двух культур позволяет выявлять, возможно, больший спектр вирусов, а комбинация клеток, обладающих различной чувствительностью к различным энтеровирусам, может помочь при идентификации выделенного цитопатогенного агента. Чрезвычайно полезным является поддержание и использование в лабораторных исследованиях культуры клеток L20B. Эта культура клеток создана на основе мышиной линии L-клеток, в которую экспрессированы человеческие рецепторы к полиовирусу. Она позволяет селективно выделять только полиовирусы, что делает ее незаменимой культурой при идентификации выделенных цитопатогенных агентов для разделения смесей вирусов. Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам представлена в табл. 2.
Таблица 2
Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам
┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐
│ Вирусы │Проявление цитопатогенного эффекта на культуре клеток│
│ ├────────────────┬──────────┬───────────┬─────────────┤
│ │ RD │ Нер-2 │ BGM │ L20B │
├─────────────────┼────────────────┼──────────┼───────────┼─────────────┤
│Полиомиелита 1-3 │ + │ + │ + │ + │
├─────────────────┼────────────────┼──────────┼───────────┼─────────────┤
│ECHO │ + │ - │ +-+ │ - │
├─────────────────┼────────────────┼──────────┼───────────┼─────────────┤
│Коксаки А │ за исключением │ │ │+- (Коксаки А│
│ │ А1, А19 А22 │ │ │ 2-6, 8,10, │
│ │ │ │ │ 14). │
├─────────────────┼────────────────┼──────────┼───────────┼─────────────┤
│КоксакиВ │ - │ + │ + │ - │
├─────────────────┼────────────────┼──────────┼───────────┼─────────────┤
│Энтеровирусы │ +- │ - │ - │ - │
│68-71 │ │ │ │ │
├─────────────────┴────────────────┴──────────┴───────────┴─────────────┤
│+ - наличие цитопатогенного эффекта; │
│- отсутствие его; │
│+- - может быть. │
└───────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
┌─────────────────┬─────────────────────────────────────────────────────┐
Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например, из лаборатории, обладающей банком клеток. Необходимо периодически контролировать чувствительность используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8-10 пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного вируса полиомиелита. После 15-20 последовательных пассажей следует перейти на свежую линию из банка клеточных культур или получить ее в референс-лаборатории. Эта процедура позволяет сохранять высокую чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток микоплазмами.
Для исследования одной пробы используют не менее двух культур клеток площадью не менее 75 см2. Это соответствует трем флаконам емкостью 50,0 мл (поверхность каждого флакона составляет 25 см2).
Два из этих флаконов должны быть с культурой клеток RD, один - с любой другой из рекомендованных культур. Флаконы со свежеобразованным монослоем клеток микроскопируют для того, чтобы убедиться в здоровом состоянии клеток. Монослой клеток, подходящий для заражения, обычно формируется в течение 2-3 дней после "посадки" клеток на флаконы при концентрации клеток 1 х 10(6) мл ростовой среды. После замены ростовой среды на 4,5 мл поддерживающей среды (без сыворотки) флаконы маркируют (указывают номер пробы, дату заражения, номер пассажа). В каждый флакон вносят по 0,5 мл обработанной исследуемой пробы воды. Все используемые клеточные линии следует инокулировать одновременно. Обязательно оставляют по 1 незараженному контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36°С. Ежедневно, обычно в течение 5-7 дней, проверяют культуры на наличие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75% клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при 20°С для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый "слепой" пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают в течение не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока культуры отбрасывают как негативные.
При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.
При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1-2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20°С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести ее ФСБ 1 : 10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать ее хлороформом и повторить процедуры заражения.
Особое внимание следует уделять предупреждению перекрестной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по возможности не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки, целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.
Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, "положительные" на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.
В лабораторной практике часто используют метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36°С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что при использовании этого метода, в результате дополнительных открываний крышек, во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрестной вирусной или бактериальной). Его рекомендуется проводить в ламинарном шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.
7. Идентификация цитопатических агентов, выделенных в реакции нейтрализации
В основе идентификации выделенных цитопатических агентов (ЦПА) в реакции нейтрализации лежит взаимодействие исследуемого вируса с гомологичной антисывороткой (или смесью антисывороток), которая нейтрализует вирус, что проявляется в виде отсутствия ЦПЭ на культуре клеток. Обычно в опыте нейтрализации вирусную суспензию, содержащую 100 ТЦД_50, смешивают с диагностическими сыворотками. После инкубации в течение 1-2 ч при 37°С, эту смесь соединяют с культурой клеток. Опыт ежедневно просматривают под микроскопом в течение не менее 3 дней. Иммунная сыворотка, которая предотвращает развитие ЦПЭ, указывает тип вируса.
При постановке реакции нейтрализации необходимо соблюдать несколько важнейших положений.
Для идентификации ЦПА всегда используют ту культуру клеток, на которой они были выделены. Если ЦПА был выделен в нескольких культурах клеток, то следует провести идентификацию каждого штамма. Это связано с тем, что в пробах воды могут содержаться смеси энтеровирусов, а чувствительность клеточных культур к различным энтеровирусам различна.
В опыте необходимо использовать разведение испытуемого изолята, содержащее 100 ТЦД_50. Для того чтобы определить необходимое разведение, проводят предварительное титрование выделенного ЦПА. Опытные лаборатории, использующие культуры клеток со стабильной чувствительностью, могут избежать этой процедуры. Известно, что суспензия вируса, полученная на культуре, где цитопатогенные изменения поражают 75-100% клеточного монослоя, содержит примерно 10(6) ТЦД_50. Поэтому в опыте используют разведения 10(-3) и 10(-4). Это экономит время исследования и материалы, необходимые для предварительного титрования. Однако контрольное титрование исследуемого изолята рекомендуется включать в каждый опыт по идентификации. Это позволяет рассчитать титр вируса в условиях данного опыта.
Реакцию нейтрализации проводят в панелях для культуры клеток с плоским дном (микрометод). Микрометод позволяет экономить все компоненты, необходимые для постановки опыта, однако при недостаточном опыте возникает опасность перекрестной лабораторной контаминации.
Титрование вирусов, а также постановку реакции нейтрализации выполняют в соответствии с документом "Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита".
8. Выявление РНК кишечных вирусов (вируса гепатита А, ротавирусов, энтеровирусов) методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции
Организация и постановка полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) для выявления РНК эитеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А из концентратов проб воды поверхностных, подземных источников, питьевой и сточных вод может быть осуществлена в лабораториях, оснащенных необходимым оборудованием.
8.1. Меры предосторожности и правила работы при постановке полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции
Организацию работы в ПЦР-лаборатории осуществляют в соответствии с документом "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утв. Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 г.
8.1.1. Лабораторию разделяют на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики.
Следует иметь не менее двух комнат:
- пре-ПЦР-помещение, где проводят обработку образцов из объектов окружающей среды (элюаты), выделение нуклеиновых кислот, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановку ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении). В этих помещениях не допускается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностику которых проводят в данной лаборатории;
- пост-ПЦР-помещение, где проводят детекцию продуктов амплицификации. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.
8.1.2. Помещение для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) располагают как можно дальше от пре-ПЦР-помещений,
8.1.3. Работу в лаборатории организовывают в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.
8.1.4. При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работу проводят в соответствии с нормативно-методическими документами.