- смесь перемешивают, осаждают центрифугированием и выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин:
- пробирки помещают в термоциклер и выдерживают 50 мин при 37-42°С (время и температуру, необходимые для работы фермента, указывают в инструкции производителя).
После синтеза кДНК на РНК матрице пробы используют для ПЦР-амплификации.
8.6.3.4. Полимеразная цепная реакция.
Амплификацию полученной в реакции обратной транскрипции кДНК осуществляют с использованием тест-системы для амплификации участка кДНК энтеровирусов длиной 207 п.н. (кат. N V-16-100-R0,5 или Кат. N V-16-100-R0,2) в соответствии с прилагаемой инструкцией.
8.6.4. Анализ амплифицированной ДНК, учет результатов
Для анализа амплифицированной ДНК используют разные методы, наиболее простым из которых является гель-электрофорез. Для постановки электрофореза можно использовать комплект стандартных реагентов для электрофореза в агарозном геле (кат. N К5-200) в соответствии с инструкцией производителя.
Учет результатов проводят визуально с помощью трансиллюминатора. При этом агарозный гель, либо достают из кюветы и помещают на стекло трансиллюминатора, либо используют емкости из УФ-проницаемых материалов.
При постановке ОТ-ПЦР для выявления в пробе "минус" цепи РНК энтеровирусов, положительные образцы должны содержать полосу ДНК размером 207 п.н. Размер полосы определяют по соотношению с положительным контролем и ДНК-маркером. Результаты можно документировать посредством фотографирования или видеосъемки геля с использованием ультрафиолетовых фильтров.
8.6.5. Интерпретация результатов, полученных с использованием культур тканей методом ОТ-ПЦР
Выявление негативной РНК ("минус" цепи РНК) энтеровирусов в пробе исследуемой воды с помощью ОТ-ПЦР зараженных культур клеток свидетельствует о присутствии в ней инфекционных энтеровирусов и интерпретируется как положительный результат молекулярного теста на инфекционность энтеровирусов.
9. Определение вирусных антигенов ротавирусов и вирусного гепатита А в иммуноферментном анализе
Элюаты, полученные после концентрирования исследуемых объемов воды, анализируют методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к готовому стандартному диагностическому набору.
10. Библиографические данные
1. Закон Российской Федерации от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. Закон Российской Федерации от 19 декабря 1991 г. N 96-ФЗ "Об охране окружающей среды".
3. Водный кодекс Российской Федерации от 16 ноября 1995 г. N 167-ФЗ
4. "Положение о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 г. N 322.
5. СанПиН 2.1.5.980-00 "Гигиенические требования к охране поверхностных вод".
6. СанПиН 2.1.4.1074-01 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества".
7. СанПиН 2.1.4.1116-02 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества".
8. СанПиН 2.1.4.1175-02 "Гигиенические требования к качеству воды нецентрализованного водоснабжения. Санитарная охрана источников".
9. СанПиН 2.1.2.1188-03 "Плавательные бассейны. Гигиенические требования к устройству, эксплуатации и качеству воды. Контроль качества".
10. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I- II групп патогенности (опасности)"
11. МУ 2.1.5.800-99 "Организация Госсанэпиднадзора за обеззараживанием сточных вод".
12. "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утверждены Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации 22 июня 1995 г.
13. МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности".
14. "Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения". М., 1980.
15. ГОСТ 2761-84 "Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения".
16. Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита. М., 1998.
17. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Женева, 2003.
18. Инструкция по использованию полимеразной цепной реакции для выявления энтеровирусного загрязнения воды. Минск, 2001.
19. Методики по санитарно-вирусологическому контролю питьевой воды и оценке ее эпидемической безопасности от 18.05.99 N 136-9811, Минск.
20. Инструкция по осуществлению санитарно-вирусологического мониторинга питьевых вод в Республике Беларусь от 11.11.00 N 138-0010, Минск.
21. Boom R., C.J.A.Sol, M.M.Salimans, CL.Jansen, P.M.E.Wertheimvan Dillen, and J. Van der Noordaa. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. J. Clin. Microbiol. 28:495-503.
22. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Eds. J. Sambrook, P. MacCallum D. Russell. CSHL Press, London: 2001,2344 p.
Список сокращений
БОЕ - бляшкообразующая единица;
ВГА - вирус гепатита А;
ВГА Аг - антиген вируса гепатита А;
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;
ИФА - иммуноферментный анализ;
МПС - макропористое стекло;
ОКВИ - острые кишечные вирусные инфекции;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с этапом обратной транскрипции;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РН - реакция нейтрализации;
РНК - рибонуклеиновая кислота;
РВ - ротавирусы;