8.1.5. Используют одноразовую пластиковую посуду.
8.1.6. Работают в одноразовых перчатках.
8.1.7. Перчатки и халаты меняют при переходе из одной зоны в другую.
8.1.8. Поверхности столов, а также помещения, в которых проводят постановку ПЦР, до начала и после окончания работ обеззараживают ультрафиолетовым излучением.
8.1.9. Для работы в ПЦР-лаборатории допускается персонал, прошедший специальную подготовку.
8.2. Меры предосторожности и правила работы при постановке электрофореза
Реагент бромистый этидий является сильным мутагеном, поэтому все манипуляции проводят с использованием перчаток. Все реагенты, содержащие бромистый этидий, перед утилизацией подвергают специальной обработке.
Отработанные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно завинчивающейся крышкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и один объем 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Добавляют один объем 2,5 М натрия гидроксида, аккуратно перемешивают. Сбрасывают нейтрализованные реактивы в канализацию.
8.3. Контроль полимеразной цепной реакции
Положительный (ПКО) и отрицательный (ОКО) контрольные образцы используют для контроля специфичности ПЦР. В качестве ПКО используют любой штамм энтеровирусов, ротавирусов и вируса гепатита А для выявления соответствующих возбудителей. В качестве ОКО используют стерильную воду, не содержащую вирусной РНК.
8.4. Выявление РНК ротавирусов и вируса гепатита А
Метод ОТ-ПЦР используют для выявления РНК вирусных агентов в исследуемых пробах воды. Исследованию подлежат элюаты проб питьевой воды, воды подземных водоисточников, речной и сточных вод. Для выделения РНК из концентратов проб питьевой воды и воды подземных водоисточников применяют метод афинной сорбции РНК на частицах силикагеля в соответствии с документом "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции", утв. Госкомсанэпиднадзором 22 июня 1995 года (для выделения РНК рекомендуется использовать готовые комплекты, например, типа "Амплисенс" и др.).
Для выделения РНК из концентратов проб воды поверхностных водоисточников и сточных вод необходимо применять метод двустадийного выделения**:
- фенол-хлороформная экстракция;
- сорбция РНК на частицы силикагеля.
8.5. Постановка реакции обратной транскрипции, проведение полимеразной цепной реакции и электрофоретический анализ продуктов полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР-амплификации)
Рекомендуется использовать ПЦР-тест-системы на вирус гепатита А и ротавирусы с электрофорезом в агарозном геле (кат. N V4-50-R0,5; V4-50-R0,2; V15-50-R0,5; 15-50-R0,2), разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном законодательством порядке.
8.6. Обнаружение энтеровирусов методом полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с использованием культуры ткани для выявления репликативной "минус" нити РНК энтеровирусов
Для подтверждения инфекционности выделенных энтеровирусов проводят первичное заражение элюатом культуры клеток, через двое суток после культивирования зараженных клеток проводят ОТ-ПЦР с культуральной жидкостью при наличии ЦПД или с лизатом клеток культур тканей - при отсутствии ЦПД. Суть методики состоит в выявлении с помощью ПЦР негативной минус цепи ("-" цепи) РНК энтеровирусов после их культивирования в культуре ткани. Негативная цепь является промежуточным продуктом репликации вируса, и ее обнаружение служит косвенным доказательством потенциальной инфекционности вируса.
8.6.1. Заражение культур клеток и их последующая обработка
Для проведения ОТ-ПЦР следует использовать не менее двух культур клеток, учитывая их чувствительность к различным типам энтеровирусов. Рекомендуется использовать следующие сочетания клеточных культур: BGM и Нер-2 или Нер-2 и RD. В пробирках (пенициллиновых флаконах) с хорошо сформированным клеточным монослоем заменяют ростовую среду на поддерживающую с 1-2% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота и добавлением антибиотиков: пенициллина в дозе до 1 000 МЕ/мл и стрептомицина в дозе до 200 мкг/мл. При культивировании клеток в инкубаторе без содержания СО2, рекомендуется для стабилизации рН в синтетические среды добавлять Hepes (25 мМ).
Маркируют пробирки (по 2 на каждую исследуемую пробу), вносят в каждую по 0,1 мл элюата и помещают в термостат (36,5-37,0°С). Для контроля оставляют по несколько пробирок с незараженной культурой (со сменой и без смены среды).
Инкубируют зараженные клетки в течение 5 суток, микроскопируя их ежедневно для контроля начала цитопатического действия. При первых признаках деградации культуры (но не позднее 5-х суток), пробирки извлекают из термостата, удаляют из них культуральную среду и промывают физраствором (или раствором Хенкса). После промывки тщательно (пипеткой) удаляют из пробирок остатки промывной жидкости.
Перед началом процедуры выделения РНК пробирки с культурой ткани, освобожденной от промывной жидкости, трижды подвергают замораживанию при -20°С и размораживанию при 37°С, что обеспечивает выход энтеровирусов из клеток культуры, после чего переходят к выделению РНК.
8.6.2. Выделение РНК
Выделение РНК можно осуществлять с использованием стандартных наборов в соответствии с инструкцией производителя, например, типа "Рибозоль", "Рибосорб" и др. РНК можно хранить в течение 1 месяца в изопропаноле при -20°С. Для длительного хранения к раствору РНК добавляют два объема 70% этанола и помещают для хранения в морозильную камеру (при -70°С).
8.6.3. Обратная транскрипция
8.6.3.1. Праймерные последовательности.
Праймерные последовательности можно синтезировать под заказ в организациях-производителях. Для постановки ИКК-ПЦР необходимо специально синтезировать 1 энтеровирусспецифический праймер, используемый на стадии обратной транскрипции (последовательность указана в табл. 3).
Таблица 3
┌──────────────┬────────────┬───────────────────────────────────────────┐
│На каком этапе│ Название │ Последовательность │
│ используется │ │ │
├──────────────┼────────────┼───────────────────────────────────────────┤
│Обратная │НП1 (прямой)│5--CGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAA-3' │
│транскрипция │ │ │
└──────────────┴────────────┴───────────────────────────────────────────┘
┌──────────────┬────────────┬───────────────────────────────────────────┐
Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, входят в состав готовой стандартной тест-системы.
8.6.3.2. Расчет рабочих концентраций праймеров.
Поставку праймеров производителем осуществляют в количествах, измеряющихся в оптических единицах (ОЕ) на мл. Для расчета рабочих концентраций праймеров необходимо перевести ОЕ в мкМ. Для праймера, длиной А пар нуклеотидов (п.н.), поставляемом в количестве В ОЕ, пересчет осуществляют следующим образом:
- определяют молекулярную массу (ММ) одноцепочечной ДНК (оцДНК) по формуле
ММ = 330 дальтон (ММ 1 п.н.) х А;
- определяют концентрацию праймера, исходя из того, что 1 ОЕ оцДНК соответствует концентрации 37 мкг/мл, соответственно В ОЕ соответствуют концентрации 37 х В мкг/мл;
- определяют концентрацию праймера С в мкМ
С = (37 х В х 1 000) / (330 х А) (мкМ).
Ряд организаций-производителей обратной транскриптазы в инструкциях по постановке реакции обратной транскрипции указывают не концентрацию праймеров в мкМ, а количество праймера, добавляемое в реакцию (в pmol). В этом случае пересчет ОЕ в pmol следует производить по формуле
D = В / (0,01 x А), где
D - количество праймера (в pmol), содержащееся в 1 мкл раствора.
8.6.3.3. Постановка реакции обратной транскрипции.
Для обратной транскрипции можно использовать готовые стандартные наборы реагентов, разрешенные к применению для этих целей в Российской Федерации в установленном порядке. В состав наборов входят буферный раствор и фермент - обратная транскриптаза (ревертаза) различного происхождения. Ингибитор РНКаз и смесь ДНТФ некоторые производители поставляют отдельно. Все компоненты реакционной смеси для обратной транскрипции можно приобретать по отдельности.
Постановка:
- в 0,2 мл (или 0,5 мл) пробирки вносят: 10,0-14,5 мкл РНК пробы, 10-20 pmol прямого праймера НП1;
- смесь аккуратно перемешивают, осаждают центрифугированием (5 с при 5 000 об./мин или с использованием вортекса) и помещают в термоциклер на 70°С 10 мин;
- по истечении времени нагревания пробирки достают и помещают на лед;
- в пробы добавляют: 5х или 10х буфер для обратной транскрипции (конечная концентрация - 1х), 1 мкл ДНТФ (100-200 мкМ), обратную транскриптазу (100-200 ед.), ингибитор РНКаз (20 ед.). Общий объем реакционной смеси составляет 20 мкл. Объем реакционной смеси при необходимости доводят с помощью свободной от РНКаз воды;