6.2.1.4 Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) - по [14].
6.2.1.5 Трипказо-соевый бульон (TSB) - по [15].
6.2.1.6 Трипказо-соевый агар (TSA) - по [15].
6.2.1.7 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А.1.1-А.1.4.
6.2.2 Среды селективные для предварительного обогащения
6.2.2.1 ПБЛ I - по [16].
6.2.2.2 Бульон Фразера полуконцентрированный (HalfFraserbroth) - по [14], [15].
6.2.2.3 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А (А.2.1, А.2.2).
6.2.3 Среды селективные для обогащения
6.2.3.1 ПБЛ II - по [16].
6.2.3.2 БульонФразера (Fraser broth) - пo [14], [15].
6.2.3.3 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А (А.3.1, А.3.2).
6.2.4 Среды селективно-диагностические
6.2.4.1 Среда ПАЛ - по [18].
6.2.4.2 Оксфордский агар (Oxfordagar) - по [14], [15].
6.2.4.3 ПАЛКАМ агар (PALCAM agar) - по [14], [15], [17].
6.2.4.4 Состав питательных сред и способы приготовления приведены в приложении А (А.4.1-А.4.3).
6.2.5 Среды для изучения биологических свойств при идентификации листерий
6.2.5.1 Питательная среда ГРМ N 1 - по [19].
6.2.5.2 Кровяной агар
К 100 см растопленного и охлажденного до 45-50 °С МПА с 1% глюкозы добавляют 5-10 см3 стерильно взятой дефибринированной крови животных. Смесь осторожно перемешивают и разливают в чашки Петри (не более 10 см3 на чашку). Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Среду подсушивают при (37±1) °С в соответствии с ГОСТ 26670 (4.2.1) и хранят не более 2 сут при температуре (4±1) °С. Среда должна иметь рН 7,2-7,4.
Для посева используют теплые чашки.
6.2.5.3 Лецитин-агар с активированным углем и без угля
К питательной среде ГРМ N 1 перед стерилизацией добавляют 0,5% активированного угля, растертого до порошкообразного состояния.
Желток куриного яйца разводят с соблюдением правил асептики в 150 см3 физиологического раствора и добавляют в количестве 5% по объему к стерилизованной и охлажденной до 40-45 °С питательной среде. Разливают в чашки Петри не более 20 см3 на чашку и подсушивают при (37±1) °С.
Аналогично готовят агар с добавлением желтка без добавления активированного угля.
6.2.5.4 Нитратную среду готовят по ГОСТ 10444.8 (3.2.9).
6.2.5.5 Полужидкую питательную среду (Listeriamotilitymedium) для определения подвижности листерий готовят в соответствии с приложением А.5.1.
6.2.5.6 Среды Гисса готовят по ГОСТ 10444.1 (5.29), используя в качестве углевода рамнозу, ксилозу, маннозу и маннит.
6.2.5.7 МПБ с 0,5% глюкозы готовят по ГОСТ 10444.1 (5.13), но при приготовлении добавляют 5 г глюкозы.
6.2.5.8 МПА готовят по ГОСТ 10444.1 (5.12).
6.3 Среды по 6.2.2, 6.2.3, 6.2.4 готовят накануне или непосредственно перед использованием в соответствии с указанием на этикетке.
Готовые среды хранят в темноте, так как отдельные компоненты, входящие в их состав, например акрифлавин, могут окисляться на свету, образуя продукты, подавляющие рост листерий.
7 Проведение исследования
7.1 Предварительное селективное обогащение
Навеску пищевого продукта массой (25±0,1) г или объемом (25±0,1) см3 по 5.1 вносят в 225 см3 одной из жидких сред для предварительного обогащения, приготовленных по 6.2.2. Содержимое встряхивают 25-кратными круговыми движениями радиусом 30 см3.
Массу навески продуктов детского, лечебного или специализированного питания отбирают по 5.1. Соотношение между количеством высеваемого продукта и питательной средой должно составлять 1:9.
Посевы культивируют при температуре (30±1) °С в течение (24±2) ч.
При росте листерий на полуконцентрированном бульоне Фразера, содержащем эскулин, отмечают почернение среды за счет гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс черного или оливкового цвета.
На ПБЛ I, не содержащемэскулин, почернение не происходит.
7.2 Селективное обогащение
После инкубирования продукта по 7.1 содержимое среды, независимо от наличия в ней изменений, в количестве 0,1 см3 пересевают в 10 см3 одной из жидких сред обогащения. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 48 ч.
На бульоне Фразера, содержащем эскулин, отмечают почернение среды, как признак возможного присутствия листерий.
На среде ПБЛ II почернение не происходит.
7.3 Выявление характерных колоний на агаризованных селективно-диагностических средах
7.3.1 Из пробирок после инкубирования по 7.2, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, в том числе почернения, делают посев бактериологической петлей из культуральной жидкости на поверхность одной из агаризованных селективно-диагностических сред, указанных в 6.2.4. Допускается проводить пересев параллельно на поверхность двух плотных селективно-диагностических сред.
Посевной материал растирают по поверхности шпателем или распределяют петлей в виде штриха. Подготовку чашек Петри со средой к посеву и посев проводят по ГОСТ 26670.
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 24-48 ч.
7.3.2 После инкубирования по 7.3.1 чашки с посевами просматривают и отмечают рост характерных колоний.
При отсутствии роста характерных колоний листерий на селективно-диагностических средах, указанных в 6.2.4, исследование прекращают и делают заключение об отсутствии Listeriamonocytogenes в исследуемой пробе продукта.