ГОСТ Р 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeriamonocytogenes. стр. 4

На среде ПАЛ рост листерий сопровождается потреблением эскулина и почернением колоний и питательной среды. Через 24 ч инкубирования они образуют мелкие серовато-желтые колонии с черным ореолом диаметром от 1,0 до 2,0 мм. Посторонняя кокковая микрофлора образует выпуклые колонии лимонно-желтого цвета диаметром от 1,0 до 4,0 мм, окруженные слабым (или без него) покраснением питательной среды.

НаПАЛКАМагаре (PALCAMagar) через 24 ч инкубирования листерий формируют мелкие серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом диаметром от 1,0 до 1,5 мм, иногда с черным центром. Через 48 ч колонии диаметром 1,5-2,0 мм приобретают зеленую окраску с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Посторонняя кокковая микрофлора образует выпуклые желтые колонии диаметром от 1,0 до 4,0 мм.

На Оксфордском агаре колонии листерий через 24 ч инкубирования - мелкие диаметром 1 мм сероватые, окруженные черным ореолом. Через 48 ч - более темные около 2 мм в диаметре с черным ореолом и углубленным центром.

При появлении сплошного роста листерий проводят пересев бактериологической петлей из зон наибольшего почернения среды штрихами на поверхность двух чашек Петри с одной из агаризованных селективно-диагностических сред, указанных в 6.2.4, для получения изолированных колоний.

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 24-48 ч.

7.3.3 Для определения принадлежности характерных колоний к бактериям рода Listeria отбирают отдельных колоний, выращенных на агаризованных селективно-диагностических средах по 7.3.1, и пересевают бактериологической петлей на среды: МПА с 1% глюкозы и/или триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA), трипказо-соевый агар (TSA), МПБ с 1% глюкозы и/или триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB), трипказо-соевый бульон (TSB).

Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 24 ч.

Получение чистой культуры проводят по ГОСТ 26670.

На МПА с 1% глюкозы листерии имеют вид мелких сероватых полупрозрачных колоний.

На триптон-соевом агаре с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и трипказо-соевом агаре (TSA) типичные колонии листерий от 1,0 до 2,0 мм в диаметре, выпуклые, бесцветные, непрозрачные.

На всех указанных средах вид колоний напоминает "капли росы".

Рост листерий на средах: МПБ с 1% глюкозы, триптон-соевом бульоне с дрожжевым экстрактом (TSYEB), трипказо-соевом бульоне (TSB) характеризуется равномерным помутнением среды, при встряхивании которой наблюдаются так называемые муаровые волны.

7.4 Подтверждение принадлежности выявленных колоний к бактериям рода Listeria

Для подтверждения принадлежности выделенных микроорганизмов к роду Listeria у полученных на средах культивирования чистых культур по 7.3.3 проверяют отсутствие капсул и спор, окраску по Граму, определяют присутствие каталазы (каталазную активность), подвижность бактерий при двух температурах инкубирования: (22±1) и (37±1) °С, нитратредуцирующие свойства.

7.4.1 Из посевов по 7.3.3 готовят препараты, окрашивают их по Граму по ГОСТ 30425 (приложение Г.2) и микроскопируют. Бактерии рода Listeria являются грамположительными тонкими короткими палочками, спор и капсул не образуют.

7.4.2 Каталазную активность культур определяют в соответствии с ГОСТ 30425 (приложение Г.1) по способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением пузырьков газа.

Бактерии рода Listeria являются каталазоположительными.

7.4.3 Подвижность культур определяют при посеве уколом в среду, приготовленную по 6.2.5.5. Посевы инкубируют при двух температурах: (22±1) и (37±1) °Св течение 48 ч.

Бактерии рода Listeria подвижны при (22±1) °С, образуют характерный рост вокруг линии укола, похожий на зонтик, и неподвижны или слабоподвижны при (37±1) °С.

7.4.4 Постановку реакции нитратредукции проводят по ГОСТ 10444.8 (4.2.5)

Бактерии рода Listeria не восстанавливают нитраты до нитритов (за исключением непатогенной Listeriagrayi).

7.4.5 Обнаружение в посевах грамположительных коротких тонких палочек, каталазоположительных, не восстанавливающих нитраты до нитритов, подвижных при (22±1) °С и неподвижных или слабоподвижных при (37±1) °С, указывает на принадлежность выделенных микроорганизмов к бактериям рода Listeria.

7.5 Подтверждение принадлежности выявленных колоний к виду Listeriamonocytogenes

Дифференциацию выделенных культур проводят в два этапа: сначала определяют принадлежность выделенных микроорганизмов к бактериям рода Listeria, а затем подтверждают их принадлежность к виду Listeriamonocytogenes.

Определение принадлежности выделенных микроорганизмов к бактериям рода Listeria проводят по 7.4.

Для подтверждения принадлежности выделенных бактерий рода Listeria к виду Listeriamonocytogenes у выделенных микроорганизмов определяют ферментативные свойства (способность ферментировать углеводы на средах Гисса с применением маннита, ксилозы, маннозы и рамнозы), -гемолитическую активность (способность образовывать зоны просветления за счет растворения эритроцитов под или вокруг колоний при посеве на поверхность кровяного агара), лецитиназную активность на средах с активированным углем и без угля, а также дополнительно проводят идентификацию Listeriamonocytogenes путем постановки реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой или антительным латексным диагностикумом "Листерия - АG-тест".

Допускается для быстрого определения ферментативных свойств Listeriamonocytogenes применять систему биохимической идентификации "APIListeria".

Допускается ускоренная идентификация Listeriamonocytogenes с применением анализатора типа "miniVIDAS", а также дополнительное использование листерийного бактериофага L-3A для идентификации.

7.5.1 Определение ферментативных свойств Listeriamonocytogenes

7.5.1.1 Культуры, полученные по 7.3.3, пересевают уколом в среды Гисса по 6.2.5.6. Посевы инкубируют до 7 сут при температуре (37±1) °С, ежедневно проверяя кислото- и газообразование. Наличие ферментативной активности в отношении углеводов определяют по изменению окраски сред за счет образования кислоты и/или газа. При появлении этих признаков проводят учет результатов. Большинство бактерий рода Listeria не ферментируют маннит (за исключением Listeriagrayi).

Listeriamonocytogenes ферментируют маннозу и рамнозу с образованием кислоты и не ферментируют маннит и ксилозу (таблица 1).

Таблица 1 - Характеристика видов бактерий рода Listeria

619 × 824 пикс.     Открыть в новом окне

7.5.1.2 Определение ферментативных свойств Listeriamonocytogenes с помощью системы биохимической идентификации "APIListeria".

При этом бактериологической петлей выделяют изолированную колонию листерий, выращенную на Оксфордском агаре или ПАЛКАМ агаре (PALCAMagar) в соответствии с 7.3.2, и вносят в пробирку с 2 см³ дистиллированной воды для приготовления суспензии по стандарту мутности, эквивалентной 1 ЕД по шкале Макфарланда.

Приготовленную суспензию вносят пастеровской пипеткой по 0,05 см³ в лунки полоски системы "APIListeria", содержащие: ESC (эскулин), -MAN (маннит), DARL (D-арабитол), XYL (ксилоза), RHA (рамноза), MDG ( -метил-D-глюкоза), RIB (рибоза), С1Р(глюкоза-1-фосфат) и TAG (D-тагатоза), избегая образования пузырьков газа. Параллельно вносят пастеровской пипеткой 0,1 см³ суспензии в лунку DIM полоски набора системы "APIListeria" для идентификации Listeriamonocytogenes от Listeriainnocua.

Полоски набора, на которые нанесена суспензия, инкубируют при температуре 35-37 °С в аэробных условиях в течение 18-24 ч и визуально учитывают результаты цветообразования по степени окраски суспензии путем сравнения с данными таблицы 2.

Заключение о наличии Listeriamonocytogenes делают на основании сравнения изменений цветообразования в лунках полоски системы "APIListeria" с данными таблицы 2 в разделе позитивной оценки.

Таблица 2 - Характеристика Listeriamonocytogenes по изменению цветообразования в лунках системы "APIListeria"

582 × 721 пикс.     Открыть в новом окне

7.5.2 Определение -гемолитической активности

7.5.2.1 Для определения -гемолитической активности выделяют изолированную колонию листерий, полученную по 7.3.3, и высевают бактериологической петлей на поверхность кровяного агара, приготовленного с добавлением стерильной дефибринированной крови животных по 6.2.5.2. Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 24 ч.

Чашки просматривают в проходящем свете и отмечают образование зон -гемолиза.

Listeriamonocytogenes обладает -гемолитической активностью с образованием узких зон просветления среды под или вокруг колоний.

7.5.2.2 Допускается вспомогательно для подтверждения гемолитической активности использовать КАМП-тест (CAMP-test).

7.5.2.2.1 Двухсуточные культуры гемолитических штаммов Staphylococcusaureus и Rhodococcusequi высевают на кровяной агар, как показано на рисунке 1. Между вертикальными линиями Staphylococcusaureus и Rhodococcusequi, как показано на рисунке 1, засевают параллельными линиями исследуемые культуры на расстоянии друг от друга не менее 1 см и от вертикальных линий - 0,5 см.

Рисунок 1 - Схема посева при постановке КАМП-теста

524 × 218 пикс.     Открыть в новом окне

7.5.2.2.2 Желательно для контроля сделать посев тест-штаммаListeriamonocytogenes 766 аналогично посеву исследуемых культур по 7.5.2.2.1.

7.5.2.2.3 Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 24 ч. Отмечают изменение (расширение и просветление) зоны гемолиза в зонах, соседствующих с вертикальными штрихами стафилококка и родококка.