Listeriamonocytogenes дает положительную КАМП-реакцию (расширение и просветление зоны гемолиза) около штриха Staphylococcusaureus и отрицательную (отсутствие изменений зоны гемолиза) - около штриха Rhodococcusequi.
7.5.3 Определение лецитиназной активности
7.5.3.1 Дно чашек Петри делят на несколько секторов или квадратов и исследуемые культуры, полученные по 7.3.3, высевают короткими штрихами по одной на сектор (квадрат). Засев каждой исследуемой культуры проводят параллельно на чашки, содержащие и не содержащие уголь.
Посевы инкубируют при температуре (37±1) °Св течение 48 ч.
Чашки просматривают в проходящем свете и отмечают наличие (отсутствие) лецитиназной активности на чашках, содержащих и не содержащих активированный уголь.
Listeriamonocytogenes дает плотную зону помутнения шириной 3,0-6,0 мм на питательной среде с активированным углем за счет гидролиза лецитина.
Listeriamonocytogenesгидролизует лецитин только в присутствии активированного угля. На среде, не содержащей активированный уголь, Listeriamonocytogenes не обладает лецитиназной активностью (таблица 1).
7.5.3.2 Желательно для контроля сделать посев тест-штаммаListeriamonocytogenes 766 аналогично посеву исследуемых культур по 7.5.3.1.
7.5.4 Постановка реакции агглютинации для идентификации Listeriamonocytogenes
Реакцию агглютинации для идентификации Listeriamonocytogenes выполняют на стекле с помощью поливалентной листериозной агглютинирующей сыворотки, содержащей антитела 0-II, V, VI, VII, IX и Н-АВ.
Предназначенную для идентификации чистую культуру, выращенную в течение 24 ч в питательном бульоне по 7.3.3 при (37±1) °С, засевают бактериологической петлей частым штрихом в две пробирки с МПА с 1% глюкозы и выдерживают в течение 24-30 ч при температуре (22±1) °С в темном месте. Культуру, выращенную на МПА с 1% глюкозы, смывают небольшим количеством физиологического раствора, чтобы получить густую взвесь (10-15 млрд. клеток в 1 см3).
Реакцию агглютинации ставят на чистых обезжиренных предметных стеклах.
На предметное стекло наносят две капли: каплю поливалентной сыворотки и каплю физиологического раствора. К обеим каплям добавляют по одной капле смыва культуры, выращенной на МПА с 1% глюкозы. Смесь тщательно и быстро перемешивают бактериологической петлей или запаянным концом пастеровской пипетки, после чего стекло плавно покачивают круговыми движениями. Одновременно ставят контрольный опыт: на предметное стекло наносят каплю поливалентной сыворотки и добавляют к ней каплю физиологического раствора.
Учет результатов реакции агглютинации проводят в течение 3 мин, отмечая появление хлопьев в капле с сывороткой. Запоздалые реакции не учитывают.
Реакцию агглютинации считают положительной при появлении хлопьев в капле с поливалентной листериозной сывороткой и отрицательной реакцией - отсутствие хлопьев в контроле.
При наличии спонтанной агглютинации реакцию агглютинации ставят повторно по указанной выше методике, но при посеве на МПА с 1% глюкозы в качестве посевного материала используют культуру, выращенную в МПБ с 1% глюкозы в течение 24 ч при температуре (22±1) °С, чтобы предотвратить повторную спонтанную агглютинацию.
7.5.5 Определение чувствительности Listeriamonocytogenes к листерийному бактериофагу L-3A для идентификации.
Допускается дополнительное определение для идентификации Listeriamonocytogenes по реакции чувствительности к листерийному бактериофагу L-3A.
Для определения используют агаровую культуру, выращенную по 7.3.3 при температуре (37±1) °Св течение 16-18 ч, которую засевают в МПБ с 1% глюкозы или МПБ с 0,5% глюкозы. Количество посевного материала должно быть таким, чтобы после встряхивания в пробирке с бульоном образовалась легкая опалесценция. Культуры подращивают в термостате при температуре (37±1) °Св течение 4 ч. После этого бактериальную взвесь наносят газоном на поверхность подсушенного МПА в чашках Петри. При подсушивании чашки открывают и переворачивают вверх дном. Агар, разлитый накануне, подсушивают 20-30 мин при комнатной температуре, а разлитый в день исследования - 1-1,5 ч при температуре (37±1) °С.
В одной чашке можно одновременно проводить анализ четырех культур. Для этого поверхность агара делят на четыре сектора. На каждый сектор наносят по 0,1 см исследуемой культуры и равномерно распределяют отдельным шпателем по отмеченному участку поверхности плотной питательной среды. Чашки с засеянными культурами выдерживают в термостате при температуре (37±1) °Св течение 1,0-1,5 ч.
Перед применением листерийного бактериофага L-3A содержимое ампул растворяют в пробирке, с МПБ, с 1% глюкозы в объеме, указанном на этикетке ампулы, и переносят в пробирки с соблюдением правил асептики. Растворенный бактериофаг не пригоден к использованию при наличии осадка, хлопьев или помутнения.
Неиспользованный в день исследования растворенный бактериофаг хранят в холодильнике при температуре 2-6 °С в течение 5-10 сут и применяют в дальнейшей работе после предварительной проверки на отсутствие бактериального загрязнения по [5].
Всю лабораторную посуду, в которой содержался бактериофаг, а также выбракованный бактериофаг и посевы после их учета обезвреживают кипячением не менее 30 мин.
Для исследования литического действия бактериофага на культуру листерий с целью ее идентификации на газон испытуемой культуры пастеровской пипеткой или бактериологической петлей наносят по одной капле бактериофага и отдельно каплю стерильного МПБ (контроль).
Место нанесения каждой капли отмечают карандашом по стеклу с наружной стороны чашки. Расстояние между наносимыми каплями должно быть не менее 1 см. Чашки после нанесения бактериофага и бульона оставляют при комнатной температуре (22±1) °С в затемненном месте.
Учет результатов проводят через 16-24 ч. Культуру признают Listeriamonocytogenes, если в месте нанесения бактериофага образуется прозрачная зона лизиса или полусливной лизис (в виде губки). Допускается наличие единичных колоний или сплошного нежного роста вторичной культуры в зоне лизиса при интенсивном бактериальном росте на остальной поверхности агара. В месте нанесения капли стерильного бульона (контроль) зона лизиса должна отсутствовать.
7.5.6 Постановка реакции пассивной агглютинации для идентификации Listeriamonocytogenes
Дополнительно для идентификации культуры, выращенной по 7.3.3, допускается использовать иммунодисперсныйантительныйлатексныйдиагностикум "Листерия - АG-тест" на основе синтетических окрашенных, монодисперсных функциональных микросфер.
Принцип метода состоит в специфическойиммуноагглютинации микросфер, сенсибилизированных листерийными антителами.
При постановке реакции пассивной агглютинации на слайдах учет реакции проводят в течение 3 мин при образовании в капле ярко выраженных хлопьев, свидетельствующих о положительном результате.
При постановке реакции пассивной агглютинации в лунках полистироловых планшетов учет результатов проводят визуально через 2-3 ч после постановки реакции. Положительным результатом наличия Listeriamonocytogenes считают тот, если в лунке планшета агглютинат имеет форму "зонтика" или равномерно распределен на дне. Отрицательным считают результат, если агглютинат оседает на дне лунки в виде колечка диаметром 1,0-1,5 мм или пуговки. Полученные результаты сравнивают с контрольными образцами, включенными в набор.
Реакцию на слайдах и полистироловых планшетах учитывают при отрицательном результате с негативным контрольным образцом и при положительном результате с позитивным контрольным образцом, включенных в диагностикум "Листерия - АG-тест".
7.5.7 Идентификация Listeriamonocytogenes с помощью иммуноферментного анализатора типа "miniVIDAS" и применением стрипового набора "VIDASLMO".
Для ускоренной идентификации Listeriamonocytogenes используют приборы иммуноферментного анализа (ИФА), в том числе типа "miniVIDAS", зарегистрированные и сертифицированные для применения в Российской Федерации как средства измерения.
Для проведения анализа 1,0 см3 обогащенной культуры на полуконцентрированном или концентрированном бульоне Фразера по 6.2.2.2 или 6.2.3.2 помещают в чистую стерильную пробирку и прогревают при температуре (100±1) °Св течение 10 мин. Полученный субстрат в количестве 0,5 см3 добавляют в незапечатанную лунку стрипаVIDASLMO. Стрип помещают в анализатор. Ввод данных производят в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. Все этапы анализа выполняются прибором автоматически.
В случае выдачи анализатором результата "Positive" делают заключение о наличии в исследуемом образце патогенных листерий. Эти результаты должны быть подтверждены исследованиями, проведенными по разделу 7 настоящего стандарта. Результаты оформляют в соответствии с разделом 8.
8 Обработка результатов
Результат оценивают по каждой пробе отдельно.
В образце констатируют присутствие Listeriamonocytogenes, если из среды накопления выделены короткие грамположительные палочки, каталазоположительные, подвижные при (22±1) °С, неподвижные или слабоподвижные при (37±1) °С, гидролизирующиеэскулин; ферментирующие с образованием кислоты рамнозу и маннозу, не сбраживающие маннит и ксилозу, обладающие лецитиназной активностью только в присутствии активированного угля и 
-гемолитической активностью.
-гемолитической активностью. Результаты выявления Listeriamonocytogenes в определенной навеске продукта записывают: "Listeriamonocytogenes обнаружены в 25 г (см3) (в 50-100 г (см3) - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта" или "Listeriamonocytogenes не обнаружены в 25 г (см3) (в 50-100 г (см3) - для продуктов детского, лечебного и специализированного питания) продукта".
9 Требования безопасности
При исследованиях пищевых продуктов на наличие Listeriamonocytogenes руководствуются СП 1.2.731-99 и правилами Минздрава СССР [20].
Акрифлавин, хлорид лития и циклогексимид, введенные в состав микробиологических питательных сред, являются токсичными веществами. Не допускается их попадание на кожу и в глаза.
Приложение А
(справочное)
Состав питательных сред
А.1 Среды для поддержания выделенных культур и культивирования бактерий рода Listeria
А.1.1 Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB)*
* По прописи фирмы "HiMediaLab. Ltd.", Индия.
Состав среды на 1 дм3, г: